在髓鞘碱性蛋白启动子的控制下表达荧光素酶(mbp-luci)的动物模型和所述模型用于生...的制作方法.docx

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专利名称:在髓鞘碱性蛋白启动子的控制下表达荧光素酶(mbp-luci)的动物模型和所述模型用于生...的制作方法
技术领域:
本发明涉及用活体动物生物成像技术制造的髓鞘碱性蛋白荧光素酶(MBP-Iuci)生物成像模型,例如用于在转录水平实时显现及量化脱髓鞘作用/髓鞘再生活动。
背景技术:
药物开发的损耗率高,据声称仅五分之一的化合物可由开发至批准(DiMasi,JA,etal,JHealthEcon22,151-185)。此外,尽管大幅增加投资,在过去三十年来引进新药物的速度仍保持相对固定,仅每年两到三种新药物进展最终投入市场(LindsayMA,NatureRevDrugDiscovery,2,831-838)。
应用于药物开发初期阶段的分子与功能性成像可提供生物活性的证据,并确认在标革El上的药效。因此,投资在分子成像技术有望提升药物开发(RudinM,etal,ProgressinDrugRes,2005,vol62,185-255)。分子成像技术较更常规读数的一项优点是,它们能够以足够的空间与时间分辨率在完整生物体中实施,用于研究体内生物过程。此外,这些分子成像技术允许在不同的时间点重复性、非侵袭性、一致性及相对自动化地研究相同的动物,从而增加纵向研究的统计效力及减少所需动物数量与成本。
MBP-Iuci模型支持增加体内早期候选药物筛选的生产力以及增加生物检测的灵敏度。早期铅化合物作为上市的药品经常不是最佳的,然而,在体内特异性及显著活性的检测可导致优化化学结构,以实现可接受的活性水平并最小化体内毒性,以治疗特定中枢神经系统疾病。分子成像分子成像是指来自各种学科方法(例如,细胞及分子生物学、化学、医学、药学、物理学、生物信息及工程学)的汇集,以在活体生物中在细胞及亚细胞水平评价特定分子过程中利用与整合成像技术(·,:545-580)。基因工程的出现对应用科学带来重大变化,例如包括药物研发路线。以相同的方式,动物成像操作的开发及利用为临床前研究提供新方法(MaggieA,,249-255)。由于难以实时量化生理活动,动物模型传统上难以处理。多年来开发了新成像方法以克服此困难(例如,MRI、CT、PET)。最近,基于体内表达荧光素酶(萤火虫的发光酶)的生物发光成像已应用于靶标基因活性的非侵袭性检测。通过结合动物基因工程与分子成像技术,使在活体动物中对特定分子过程进行动态研究成为可能。这种方法能够潜在地影响临床前规程,从而广泛改变医学的所有方面(,337)。分子成像生物发光体内生物发光成像(BLI)是一种灵敏工具,其基于检测来自细胞或组织的放射光。报道基因技术的应用使
得可通过体内成像方法分析活体动物内特定细胞与生物过程。生物发光(活体生物酶促产生可见光)是许多非哺乳动物物种中自然发生的现象(Contag,CH,:593-603)。荧光素酶是催化底物氧化以释放光的光子的酶(GreerLFIII,Luminescence17:43-74)。来自北美萤火虫的生物发光最为广泛应用。萤火虫荧光素酶基因(Iuc)的表达产生荧光素酶,其将底物D-荧光素转化为非反应性的氧化荧光素,从而导致放射562纳米的绿光。由于哺乳动物组织不会天然放射生物发光,体内BLI具有相当吸引力,因为可产生具非常小背景信号的图像。BLI需要使用由生物发光报道基因组成的表达盒(expressioncassette)在选择的驱动光报道基因的基因启动子的控制下基因工程化细胞或组织(FIGl)。为了诱发光产生,通过颈内、血管内、腹膜内内或皮下注射给药底物(例如,荧光素)。荧光素酶/荧光素放射的光能够穿透数毫米至厘米的组织深度;然而对于每一厘米组织深度,光子强度减少约十倍(:593-603)。必须使用灵敏的光检测仪器检测体内生物发光。该检测器测量每一单位面积放射的光子数目。波长介于400及1000纳米之间的低水平光可被电荷耦合组件相机检测,电荷耦合组件相机将撞击娃片的光子转换为电子(SpibeyCPetalElectrophoresis22:829-836)。软件能够将电子信号转换为二维图像。软件也能够量化放射光线的强度
(撞击检测器的放射光子的数目),并将这些数值转换为假***形。实际数据以光子计数测量,但假***形使得能够快速目视判读。对于更细微的差异,可能需要在关注区域内的定量测量。冷却电荷耦合组件相机的使用降低热噪声,以及暗箱使荧光素酶产生的光可被最佳显现及量化(ContagCH,:235-260)。有用的是,将荧光素酶图像叠加在其它类型图像如自显影照片或放射线照片上用于放射信号的解剖定位(图2)。该软件叠加图像用于显现及判读。脱髓鞘疾病、少突胶质细胞及髓鞘碱性蛋白髓鞘碱性蛋白(MBP)为正常髓鞘紧密性及功能所需。与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)及蛋白脂质蛋白(PLP)—起,这些蛋白质构成髓鞘结构蛋白家族的成员,并由以下的髓鞘生成细胞合成在中枢神经系统(CNS)中的少突胶质细胞,和在周围神经系统(PNS)中的许旺细胞。在发育中的中枢神经系统中,髓鞘碱性蛋白的表达与髓鞘形成时期一致。因此,在本领域中将髓鞘碱性蛋白视为少突胶质细胞成熟的标记。髓鞘碱性蛋白(与其它蛋白质一起)的高水平表达与髓鞘精细化过程一致,在髓鞘形成的整个过程中持续,并在轴突分裂时结束(:133-141)。影响髓鞘完整性的疾病导致在受影响的神经元中轴突信号传导受损,以及可导致感觉、运动、认知或其它功能受损,取决于涉及的神经元。术语脱髓鞘疾病描述该疾病的结果,而非原因,以及可由遗传、传染剂、自身免疫反应及未知因素导致。所有这些仍为庞大未满足医疗需求的人类病痛,常与康复疗法的需求有关。中枢神经系统的脱髓鞘疾病包括
·多发性硬化(与类似疾病一起称为自发性炎性脱髓鞘疾病)横贯性脊髓炎德维克病进行性多病灶脑白质病视神经炎脑白质营养不良
·Pelizaeus-Merzbacher病(Pelizaeus-Merzbacherdisease)·髓鞘功能障碍/丧失,也与脊髓损伤、阿尔茨海默病与帕金森病及精神分裂症有关周围神经系统的脱髓鞘疾病包括·吉兰-巴雷综合征(Guillain_Barr6syndrome)及其慢性相似病,慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病周围神经病(***引起、糖尿病、抗-MAG等)·夏科-马里-图斯病(Charcot-Marie-ToothDisease)脱髓鞘作用的体内模型在开发对抗脱髓鞘疾病的临床前候选药物中的一般步骤是评价治疗性候选药物在动物模型中的作用,该动物模型概括部分或全部的脱髓鞘作用,且其具有内源性髓鞘再生能力。可在动物模型中实现化学诱导的脱髓鞘作用,以及6-8周龄的年轻成年雄性小鼠易受4-%铜宗(cuprizone;双环己***草酰二腙)饮食造成的脱髓鞘作用影响(LudwinSK,1978,LabInvest39:597-612)。经铜宗处理,脱髓鞘作用发生在整个脑部,但在高度集中的白质区(胼胝体)内最易检测(Merkleretal,2005,NMRBiomed18:395-403)。在开始铜宗饮食后的
3周内脱髓鞘作用明显。以正常食物替代该饮食,在4-6周内允许几乎完全髓銷再生(Matsushimaetal,2001,BrainPathol11:107-116)。使用淀粉样前蛋白或比尔朔夫斯基银浸渗法(Bielschowsky’silverimpregnation)对轴突损伤的免疫组织化学染色无法在8周龄小鼠中显露很多轴突损伤(Merkler)。然而,在6_7月龄的小鼠中,轴突横断显著增加,部分造成在老年动物中可见的髓鞘再生下降(IrvineKA,etal,2006,JNeuroimmunol175:69-76)。少突胶质细胞祖细胞在分化后取代髓鞘,以及小神经胶质细胞与巨噬细胞二者在铜宗饮食约4周时达到高峰,并且为有效髓鞘再生所需(FrancoRJM,2002,NatRev3:705-714)。为量化髓鞘含量的变化,可收取整个大脑或亚区,并由斑点印迹或Western分析评价。可选择地,追踪髓鞘丧失及修复的亚区的更高分辨率的敏锐(与纵向相对)方法涉及定量立体学。例如,计算机辅助立体学工具箱(CAST)系统可用于评价胼胝体中的髓鞘勒克司坚牢蓝(LuxolFastBlue)(髓鞘染剂)的变化。甲苯***蓝及电镜术是必要的最后步骤,以确保致密髓鞘完全套住先前裸露的轴突。至于纵向评价方面,T2加权的磁共振成像提供了定量评价喂食铜宗的小鼠的胼胝体中髓鞘变化的方法(sanofi-aventisNeurology,2008unpublishedresults)。实时追踪体内髓鞘形成状态的髓鞘碱性蛋白荧光素酶生物成像模型在一篇2OO3年的论文,Farhadi等人
(TheJournalofNeuroscience,November12,2003,23(32):10214-10223)报导,髓鞘碱性蛋白启动子含有调节元件一四个宽阔间隔的保守模块M1、M2、M3及M4,,其对髓鞘形成与髓鞘再生的时机调节非常重要(参见图1、3及4)。他们使用半乳糖酶基因(LacZ)为报道基因,证明当中枢神经系统发育时,近端模块Ml及M2在少突胶质细胞中驱动相对低水平的表达,而上游M3区域在少突胶质细胞整个发育过程及成熟中枢神经系统中驱动高水平的表达。而且,在脱髓鞘损伤后髓鞘再生期间的表达需要此M3区域。M4也在髓鞘化许旺细胞中驱动髓鞘碱性蛋白的表达。
目前方法使用动物模型测定体内髓鞘的变化十分耗时,一般花费4至8周且需大量动物。该髓鞘碱性蛋白脱氧核糖核酸启动子包含表达荧光素酶基因的所有4个特异性调节区,构成鼠髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因生物成像模型的基础,所述鼠髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因生物成像模型被开发以实时追踪脑、脊髓和/或周围神经系统中髓鞘碱性蛋白(MBP)转录活性的变化。可将这种啮齿动物转基因模型用于选择治疗人类脱髓鞘疾病候选药物开发的基础研究的体外及体内证明,并对现有模型提供多重改良〇通过生物发光非侵袭性追踪神经系统髓鞘形成的变化的能力显著降低与事后组织化学及组织表达分析相关的资源及人力需求。〇纵向研究大大增加模型对髓鞘形成的变化的灵敏度。先前的测定法必须在每一时间点使用单独动物群,如此则限制研究过程中可收集的数据点数量。由于需要单
独动物群而导入额外变量。〇迅速处理生物成像数据,通常在同一日,因此允许调整(即,延长研究期间以达到显著性或由于缺乏药物的影响而提早终止),以优化研究设计并减少不必要的资源投资。〇动物群及相应的处理法均可在零时间点测定,其在降低每一处理群动物数量的同时优化研究的统计显著性。可将研究数据标准化为初始值,从而大大降低固有的生物学上的变异,同时支持对特定疗法效果的更有力的结论。
发明内容
本发明提供一种新的体内模型,以评价治疗个体对于脱髓鞘作用(例如,神经保护、髓鞘保护)与髓鞘再生(例如,修复)的程度的效果。本发明的生物成像动物及化合物筛选方法允许通过在活体动物中产生相关实时高分辨率数据,来筛选和/或检验药用化合物及其它治疗剂的本质确证。此外,可获得关于潜在毒性、ρκ/ro及治疗窗的评价,从而对灵长类及人类的剂量有更精准预测。本发明提供对使用活体转基因模型生物体研究髓鞘形成活动的改良工具及方法。与其它模型相比,由于每个受试者可作为其本身纵向研究的基线对照,本发明降低所需的受试者总量。生物间差异性因此降低,从而增进统计结果的可信度。在本发明的各个方面,实现不同的优势。在下面的讨论中描述多种用途中的数种的特点。通
过与髓鞘碱性蛋白表达的相关性,本发明提供在活体模型生物体中监测脱髓鞘作用和/或髓鞘再生活动的方法。该方法可包含转基因修饰祖细胞,以产生表达通过髓鞘碱性蛋白启动子驱动的荧光素酶基因的模型生物体。当表达时,荧光素酶基因可起作用以在底物如荧光素的存在下产生光(生物发光)。通过监测来自该生物体的生物发光,可评价髓鞘形成与脱髓鞘作用活性。成像设备及分析允许快速使生物发光及髓鞘形成活动与生物的身体的特定部分相关联。对于研究中枢与周围神经系统的活动,在神经组织中使用髓鞘的脊椎动物生物体是特别适宜的模型生物体。哺乳动物是在中枢与周围神经系统中使用髓鞘帮助神经传导的生物体。普通哺乳动物模型如啮齿动物(例如,大鼠、小鼠)、兔、绵羊、灵长动物、天竺鼠等为适用于实践本发明的模型生物体。生物体尺寸本质上不是限制因素。然而,可将仪器尺寸优化为特定生物体形状或尺寸。
单一生物成像活动可提供所需的信号。然而,本发明的优点提供在相同动物上历经多个时间点重复测量并比较多个测量结果的能力。单一生物体因此作为其本身对照或基线。因此,在单一生物体中历经一个或多个脱髓鞘作用或髓鞘再生间隔的生物成像是可能的。此外,贯穿脱髓鞘作用或髓鞘再生间隔的成像信号标准化产生更多有力数据,其中贯穿重复间隔的成像可有效检测历经一个或多个活动在生物体中髓鞘碱性蛋白转录水平的变化。生物发光信号被身体组织衰减。因此,近体表的神经组织产生较强信号。检测器的信号可通过以下方法提高通过使更多荧光素酶反应而产生较高信号输出,例如,使用较高浓度,或增加酶活性或表达水平。使用较高灵敏度的检测器也可改善数据收集。较高灵敏度的检测器常需要冷却设备以产生明显信号并最小化噪声。也使用收集数据的时间增加信号的数量。
本发明的模型生物体可为含有荧光素酶基因的转基因动物,所述荧光素酶基因通过髓鞘碱性蛋白启动子驱动。该动物可为哺乳动物,例如,用作动物模型的任何哺乳动物。大鼠与小鼠是普通动物模型。当将启动子活化或开启时,在髓鞘碱性蛋白启动子的控制下荧光素酶基因在模型的特定目标组织中表达。该髓鞘碱性蛋白启动子可含有Ml至M3,或可含有Ml至M4。可通过简单操作实现信号的改善,例如,选择毛发造成较少衰减的模型。例如,毛发较C57/B6小鼠较少影响衰减的模型将提供较优于C57/B6小鼠的信号。本发明也提供研发用于生物成像的模型生物体的方法。研发可通过以下方法实现以例如小鼠品系开始并生产转基因动物,然后选择一个或多个系,其中在出生后髓鞘形成高峰时的体内完整小鼠成像显现特异性成像(例如,中枢神经系统);然后选择一个或多个系,其中体外成像确认在希望区域(例如,主要在脑的致密白质区