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在限定核苷酸间键环境下的诱导特异性免疫调节特性的rna序列基序的制作方法.docx


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专利名称::.§119(e)要求提交于2007年8月13日的题目为“处在限定的核苷酸间键的环境下的诱导特异性免疫调节状况的序列基序”的美国临时申请第60/964,448号的优先权,本文通过参考并入其全部内容。
背景技术:
:Toll样受体(TLR)是一个高度保守的模式识别受体(PRR)多肽家族,它们识别病原体相关分子模式(PAMP)并且在哺乳动物的天然免疫中起着至关重要的作用。目前,已经鉴定出至少10个家族成员,这些成员被指定为TLRlTLR10。各种TLR的胞浆域的特征是Toll-白细胞介素1受体(TIR)域(MedzhitovR等,(1998)MolCell2:253_8)。TLR对微生物入侵的识别引发了果蝇和哺乳动物中在进化中得到保留的信号级联的激活。据报道,含TIR域的衔接蛋白MyD88与TLR相关并将白细胞介素1受体相关激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6(TRAF6)募集至TLR。据信MyD88依赖性信号途径导致NF-B转录因子和c-JimNH2端激酶(Jnk)丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的激活,这些是免疫激活和产生炎性细胞因子的关键步骤。有关综述可参见
AderemA等(2000)Nature406:782-87,和AkiraS等(2004)NatRevImmunol4:499-511。已经鉴定出许多特异性TLR配体。TLR2的配体包括肽聚糖和脂肽(YoshimuraA等(1999)JImmunol1631-5;YoshimuraA等(1999)JImmunol1631-5;AliprantisAO等(1999)Science285:736_9)。脂聚糖(LPS)是TLR4的配体(PoltorakA等(1998)Science2822085-8;HoshinoK等(1999)JImmunol162:3749_52)。细菌鞭毛蛋白是TLR5的配体(HayashiF等(2001)Nature410:1099_1103)。据报道肽聚糖不仅是TLR2的配体也是TLR6的配体(OzinskyA等(2000)ProcNatlAcadSciUSA9713766-71;Takeuchi0等(2001)IntImmunol13:933-40)。近来,据报道某些低分子量合成化合物即咪唑并喹啉类(咪喹莫特(R-837)和雷西莫特(R-848))是TLR7和TLR8的配体(HemmiH等(2002)NatImmunol3196-200JurkM等(2002)NatImmunol3:499)。从发现未***化的细菌DNA及其合成类似物(CpGDNA)是TLR9的配体开始(HemmiH等(2000)Nature408740-5;BauerS等(2001)ProcNatlAcadSciUSA98,9237-42),已报道某些TLR的配体包括某些核酸分子。近来,已报道某些类型的RNA是以非序列依赖性或序列依赖性的方式的免疫刺激性的。此外,还报道了这些不同免疫刺激
RNA会刺激TLR3、TLR7禾口TLR8。
发明内容本发明广泛地涉及含有某些免疫刺激序列基序的免疫刺激聚合物,并且还涉及含有这类免疫刺激聚合物的免疫刺激组合物以及这些免疫刺激聚合物和组合物的使用方法。在本发明的某些方面,所述免疫刺激聚合物是免疫刺激寡核糖核苷酸(ORN)。本发明的免疫刺激聚合物可以用于需要刺激或提高免疫应答的任何场合或应用中。如下文所公开,本发明的免疫刺激聚合物可特别用于制备包含佐剂、疫苗和其它药物的药物组合物,该药物组合物用于治疗包括感染、癌症、过敏症和哮喘的多种病况。因此,在某些方面,本发明涉及包含本发明的免疫刺激聚合物的组合物以及它们的使用方法。如下文所详细公开,本发明的免疫刺激聚合物的特征在于它们包含至少一个序列依赖性免疫刺激基序序列。据公开,序列依赖性免疫刺激基序序列和包含这些基序的聚合物是TLR7相关细胞因子干扰素α(IFN-α)的有力诱导物。在一方面,本发明提供了一种包含含有rNfrC-rU-rC-rA-r^的长度为4100单元的单链聚合物的组合物,其中所述聚合物在基序rC-rU-rC-rA之外不含U,其中所述聚合物包含磷酸二酯主链,其中N1和N2中的至少一个不是A7,且其中rNi-rC-rU-rC-rA-rR不是G⑶CAA。在一个实施方式中,所述组合物还包含输送载具,其中所述输送载具是脂质体、非离子囊泡
(noisome)、脂质复合体(lipoplexe)、聚合物复合体(polyplexe)、脂质聚合物复合体(Iipopolyplexe)、油包水(W/0)乳液、水包油(0/W)乳液、水包油包水(W/0/W)多重乳液、微乳液、纳米乳液、胶束、树枝状聚合物、病毒颗粒、类病毒颗粒、聚合物纳米颗粒(如纳米球或纳米胶囊)或聚合物微粒(如微球或微胶囊),且其中所述组合物不含lipofectin。在一个实施方式中,N1包含至少一个Α。在另一个实施方式中,N1包含至少一个C。在再一个实施方式中,N1包含至少一个G。在又一个实施方式中,N1包含至少一个T。在一个实施方式中,N2包含至少一个A。在另一个实施方式中,N2包含至少一个C。在再一个实施方式中,N2包含至少一个G。在又一个实施方式中,N2包含至少一个T。在另一方面,本发明提供了一种包含含有免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4的长度为4100单元的组合物,其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸,其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸,其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序,且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAXfUCAC(SEQIDNO34),其中X1是A或C。在一个实施方式中,所述组合物还包含输送载具,其中所述输送载具是脂质体、非离子囊泡、脂质复合体、聚合物复合体、脂质聚合物复合体、油包水
(W/0)乳液、水包油(0/W)乳液、水包油包水(W/0/W)多重乳液、微乳液、纳米乳液、胶束、树枝状聚合物、病毒颗粒、类病毒颗粒、聚合物纳米颗粒(如纳米球或纳米胶囊)或聚合物微粒(如微球或微胶囊),且其中所述组合物不含lipofectin。在一个实施方式中,X2是Α。在一个实施方式中,&是(。在另一个实施方式中,X2是6。在一个实施方式中,X3是々。在另一个实施方式中,X3是C。在又一个实施方式中,X3是6。在一个实施方式中,N3包含至少一个A。在另一个实施方式中,N3包含至少一个C。在再一个实施方式中,N3包含至少一个G。在又一个实施方式中,N3包含至少一个U。在一个实施方式中,N4包含至少一个A。在另一个实施方式中,N4包含至少一个C。在再一个实施方式中,N4包含至少一个G。在又一个实施方式中,N4包含至少一个U。上述组合物可以包含其它要素或所述聚合物的修饰物。例如,在一个实施方式中,所述组合物还包含抗原。在一个实施方式中,所述抗原与所述聚合物接合。在一个实施方式中,rNrrC-rU-rC-rA-rN2或rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4基序包含修饰的核苷碱基,所述修饰的核苷碱基选自次黄嘌呤、肌苷、8-氧代腺嘌呤及其7-位取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、S-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-***尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-
羟***尿嘧啶、5-***尿嘧啶、5-***尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-***胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-***胞嘧啶、5-***胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-***嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-脱氮-7-位取代嘌呤、7-脱氮-8-位取代嘌呤、氢(无碱基残基)及其任何组合。在另一个实施方式中,所述聚合物在rNi-rC-rU-rC-rA-rR基序之外还包含至少一个修饰的核苷碱基,其中所述修饰的核苷碱基选自次黄嘌呤、肌苷、8-氧代腺嘌呤及其7-位取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、S-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-***尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-羟***尿嘧啶、5-***尿嘧啶、5-***尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-***胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-***胞嘧啶、5-***胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二***鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-位取代鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-位取代鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-***嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7_脱氮嘌呤、7-脱氮-7-位取代嘌呤、7-脱氮-8-位取代嘌呤、氢(无碱基残基)及其任何组合。在另一个实施方式中,所述组合物还包含与该聚合物共价相连的亲脂部分。在一个实施方式中,所述亲脂部分选自胆留烯基、棕榈酰基和脂肪酰基。在另一个实施方式中,所述聚合物不含
CpG基序。在再一个实施方式中,所述聚合物不包含CCGAGCCGAGOTCACC(SEQIDNO:35)。在一个实施方式中,所述聚合物的长度为420单元。在另一个实施方式中,所述聚合物的长度为1025单元。在再一个实施方式中,所述聚合物的长度为1519单元。在一个实施方式中,每个聚合物单元都是核糖核苷酸。在另一个实施方式中,聚合物单元是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。在再一个实施方式中,所述脱氧核糖核苷酸包括处于所述聚合物的5’端的TCG基序。在又一个实施方式中,所述聚合物的至少一个单元是氨基酸。在一个实施方式中,所述聚合物与TLR9激动剂相连。在另一个实施方式中,所述TLR9激动剂是小分子。在再一个实施方式中,所述聚合物与TLR7激动剂相连。在又一个实施方式中,所述聚合物与TLR8激动剂相连。在另一方面,本发明提供了一种方法,所述方法包括使能产生IFN-α的免疫细胞与长度为4100单元的单链聚合物接触,所述单链聚合物的量能有效地诱导产生治疗上显著量的IFN-α,其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN^rC-rU-rC-rA-r^且在基序rC-rU-rC-rA之外不含U,其中所述聚合物包含磷酸二酯主链,其中N1和N2中的至少一个不是A7,且其中rNfrC-rU-rC-rA-rR
不是GCUCAA或UUAUCGUAX!CUCAC(SEQIDNO:34),其中X1是A或C,其中所述聚合物不与Iipofectin—起配制。在一个实施方式中,所述聚合物包含至少一个在所述免疫刺激基序之外的稳定化键。在另一个实施方式中,所述聚合物包含15个在所述免疫刺激基序之外的稳定化键。在一个实施方式中,所述稳定化键处在5’端和/或3’端。在又一方面,本发明提供了一种方法,所述方法包括使能产生干扰素α(IFN-α)的免疫细胞与长度为4100单元的单链聚合物接触,所述单链聚合物的量能有效地诱导产生治疗上显著量的IFN-α,其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4,其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸,其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸,其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序,且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAXfUCAC(SEQIDNO:34),其中X1是A或C,其中所述聚合物不与Iipofectin—起配制。在一个实施方式中,上述方法不会导致免疫细胞应答于所述聚合物而产生显著量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素、(TNF-γ)或白细胞介素12(IL-12)。在某些实施方式中,所述方法在体内进行。在某些实施方式中,将所述聚合物以如上所述的任何组合物的形式进行施用。在另一方面,本发明提供了一种哮喘治疗方法,所述方法包括对患有哮喘的受试对象施用哮喘治疗用有效量的长度为
4100单元的单链聚合物,其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rNfrC-rU-rC-rA-rR并且在基序rC-rU_rC_rA之外不含U,其中所述聚合物包含磷酸二酯主链,其中N1和N2中的至少一个不是A7,且其中rNi-rC-rU-rC-rA-rR不是GCUCAA或UUAUCGUAXfUCAC(SEQIDNO:34),其中X1是A或C。在再一方面,本发明提供了一种哮喘治疗方法,所述方法包括对患有哮喘的受试对象施用哮喘治疗用有效量的长度为4100单元的单链聚合物,其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4,其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸,其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸,其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序,且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAXfUCAC(SEQIDNO:34),其中X1是A或C。在一个实施方式中,上述哮喘治疗方法的任何一种还可以包括对受试对象施用过敏原。在一个实施方式中,所述聚合物与所述过敏原接合。在某些实施方式中,将所述聚合物以如上所述的任何组合物的形式进行施用。在另一方面,本发明提供了一种过敏病况的治疗方法,所述方法包括对患有过敏病况的受试对象施用过敏病况治疗用有效量的长度为
4100单元的单链聚合物,其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rNfrC-rU-rC-rA-rR并且在基序rC-rU_rC_rA之外不含U,其中所述聚合物包含磷酸二酯主链,其中N1和N2中的至少一个不是A7,且其中rNrrC-rU-rC-rA-rN2不是GCUCAA或UUAUCGUAX!CUCAC(SEQIDNO:34),其中X1是A或C。在再一方面,本发明提供了一种过敏病况的治疗方法,所述方法包括对患有过敏病况的受试对象施用过敏病况治疗用有效量的长度为4100单元的单链聚合物,其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4,其中X2和X3相互独立地不存在或者为选自由C、G和A构成的核苷酸及其核苷酸类似物的核苷酸,其中N3和N4相互独立地不存在或者为一个或多个核苷酸,其中所述聚合物包含磷酸二酯主链且不包含两个A7基序,且其中rN3-rX2-rC-rU-rC-rA-rX3-rN4不是GCUCAA或UUAUCGUAXfUCAC^SEQIDNO34),其中X1是A或C。在一个实施方式中,上述过敏病况的治疗方法的任何一种还可以包括对受试对象施用过敏原。在一个实施方式中,所述聚合物与所述过敏原接合。在某些实施方式中,将所述聚合物以如上所述的任何组合物的形式进行施用。在另一方面,本发明提供了一种癌症治疗方法,所述方法包括对患有癌症的受试对象施用癌症治疗用有效量的长度为4100单元的单链聚合物,其中所述聚合物包含免疫刺激RNA基序rNfrC-rU-rC-rA-rR

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