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·论著·
生***饮食对裸鼠人结肠癌皮下瘤生长的影响
王楷,黄思辉,吴腾飞,肖敏,邱振雄(通信作者)
深圳市宝安区中心医院普外科 (广东深圳 518000)
〔摘 要〕目的 构建结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察生***饮食(KD)对移植瘤生
长的影响。方法 选取10只雄性SPF裸鼠,对其予以皮下接种HCT116结肠癌细胞构建裸
鼠结肠癌移植瘤模型,接种当天将裸鼠随机分为正常饮食组(对照组)及KD饮食组(KD
组),每组5只,成瘤前两组均自由进食,成瘤5mm开始对照组自由进食标准饲料,KD组
进食相等能量的生***饲料,期间隔天记录1次两组的体质量变化,于饮食30d后,处死两
组并测量瘤体组织的大小,并经脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法
(TUNEL)检测移植瘤组织细胞凋亡情况,经实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测半胱氨
酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)和Caspase9mRNA表达情况,经WesternBlot免疫印迹法
检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X(Bax)蛋白表达情况。结果 与对照组
比较,KD组细胞凋亡率、Caspase3、Caspase9mRNA及Bax蛋白表达水平均升高,Bcl-2
蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<)。结论 KD可抑制裸鼠结肠癌移植瘤生
长,其是通过提高Caspase3和Caspase9mRNA及Bax蛋白表达水平、降低Bcl-2蛋白表达
水平实现的。
〔关键词〕生***饮食;结肠癌;裸鼠皮下瘤;凋亡
〔中图分类号〕〔文献标识码〕B〔文章编号〕1002-2376(2022)06-0009-04
InfluencesofKetogenicDietonSubcutaneousTumorGrowthofHumanColonCancer
inNudeMice WangKai,HuangSihui,WuTengfei,XiaoMin,QiuZhenxiong(Corre-
spondingAuthor).DepartmentofGeneralSurgery,Bao'anCentralHospitalofShenzhen,
ShenzhenGuangdong518000,China
【Abstract】Objective Thesubcutaneoustransplantedtumormodelofcoloncancerin
nudemicewasestablishedtoobservetheinfluencesofketogenicdiet(KD)onthegrowthof
10maleSPFnudemicewereselectedandtransplantedtumor
modelofcoloncancerinnudemicewasestablishedthroughsubcutaneousinoculationof
,thenudemicewererandomlydi-
videdintoanormaldietgroup(controlgroup)andaKDdietgroup(KDgroup),with5nude
,
diametersofthetumorsreached5mm,thecontrolgroupwerefreetoeatstandardfeed,
whiletheKDgroupwasfedketogenicfeedwiththesameenergy,andthechangesofbody

ofdiet,bothgroupsweresacrificedandthesizeoftumortissuesweremeasured,andthe
apoptosisoftransplantedtumortissueswasdetectedbyTdT-mediateddUTPNick-EndLabe-
ling(TUNEL).Besides,theexpressionsofcysteineaspartateprotease3(Caspase3)and
Caspase9mRNAweredetectedbyreal-timefluorescencepolymerasechainreaction(PCR),
andtheexpressionsofB-celllymphoma-2(Bcl-2)andBcl-2-associatedX(Bax)protein
Comparedwiththecontrolgroup,the
apoptosisrate,theexpressionlevelsofCaspase3andCaspase9mRNAandtheexpression
收稿日期:2021-11-14
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levelofBaxproteinallroseandtheexpressionlevelofBcl-2proteinreduced,andthediffer-
enceswerestatisticallysignificant(P<).Conclusion KDcaninhibitthegrowthoftrans-
plantedtumorofcoloncancerinnudemicebyincreasingtheexpressionlevelsofCaspase3and
Caspase9mRNAandBaxprotein,anddecreasingtheexpressionlevelofBcl-2protein.
【Keywords】 Ketogenicdiet;Coloncancer;Subcutaneoustumorinnudemice;Apoptosis
结肠癌是一种威胁全人类健康的恶性消化道入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇
肿瘤,据WHO报道,,再将切片移入湿盒中,在
结肠癌新发病例,。在我每个样本上滴加50μg/mlProteinaseK工作液,
国,尤其是城市地区,随着人们饮食结构的改变,于37℃下反应30min进行修复,然后用磷酸盐
结肠癌发病率的上升趋势加快[1]。有研究认为,缓冲液(phosphatebuffersolution,PBS)充分洗
低纤维饮食、家族史、饮酒、精神问题等是结肠涤3次,5min/次,用吸水纸吸掉组织周围的
癌发病的危险因素[2-4]。生***饮食(ketogenicdi-PBS;在每张玻片上滴加足够量的脱氧核糖核苷
et,KD)作为一种含有天然脂肪、适当配比的蛋酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-me-
白质及碳水化合物的组合饮食,在治疗癫方面具diateddUTPNick-EndLabeling,TUNEL)检测
有良好的效果[5],对代谢性疾病,如肥胖、糖尿液,于37°C下避光孵育1h,然后再用PBS洗涤
病、高血压、肿瘤亦具有一定的治疗效果[6-8]。且3次,5min/次,用吸水纸吸干玻片上的液体,用
有研究发现,KD可对裸鼠皮下移植瘤生长起到显抗荧光淬灭封片后于荧光显微镜下观察。
著的抑制作用[9],但具体的机制尚不明确, 实时荧光PCR
此,本研究将进一步探讨其作用机制。按照RNA提取试剂盒说明书进行RNA提取操
1 材料与方法作,%焦碳酸二乙酯(di-
实验动物ethylpyrocarbonate,DEPC)水浸泡并经高压灭活,
10只雄性5周龄SPF裸鼠,由湖南斯莱克景然后进行RNA含量测定,即取RNA样品并加入
达实验动物有限公司提供,许可证号:SCXK99μlDEPC处理水,用紫外分光光度计测260、
(湘)2016-0002。280nm光密度(opticaldensity,OD)值,计算
主要试剂及仪器OD260/OD280比值,~,则
生***饲料(江苏美迪森生物医药有限公司),认为制备的RNA较纯,随后使用逆转录试剂盒将
HCT116结肠癌细胞(纳生物技术有限公司),mRNA逆转录为cDNA反应;设计基因特异性引
TUNEL检测试剂盒(南通碧云天生物技术有限公物,釆用20μl反应体系,尽量在避光条件下加入
司),RNA提取试剂盒(北京康为世纪生物技术有所需成分,充分混匀,并使所有试剂沉积于管底,
限公司),逆转录试剂盒(诺唯赞生物技术有限公随后应用CFXConnectTM实时荧光PCR仪进行聚合
司);CFXConnectTM实时荧光PCR仪[伯乐生命酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)扩
医学产品(上海)有限公司],MF53倒置荧光显增及检测。引物由通用生物系统(安徽)有限公
微镜(广州市明美光电有限公司),BQ-318D切司合成,序列见表1。
片机(伯纳生物技术有限公司)。表1 引物名称及序列
裸鼠成瘤及药物处理引物名称引物序列
对10只雄性SPF裸鼠予以皮下接种HCT116结Caspase3FCCACAGCACCTGGTTATTATTCTTG
肠癌细胞(浓度为5×106个/ml,),在Caspase3RATTCTGTTGCCACCTTTCGG
Caspase9FTGTCTACGGCACAGATGGAT
瘤体为5mm后,根据瘤体大小将裸鼠随机分为正
Caspase9RAGGAAACAAAACCTGGGAAA
()KD(KD),
常饮食组对照组及饮食组组每组GAPDHFTGACTTCAACAGCGACACCCA
5只,成瘤前两组均自由进食,成瘤5mm开始对照GAPDHRCACCCTGTTGCTGTAGCCAAA
组自由进食标准饲料,KD组进食相等能量的生***饲 注:Caspase3为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,Caspase9为半胱
料,期间隔天记录1次两组的体质量变化,于饮食氨酸天冬氨酸蛋白酶9,GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶
30d后,处死两组并测量瘤体组织的大小。 WesternBlot免疫印迹法检测
TUNEL染色将瘤体组织研磨成浆后,加入含有蛋白酶抑
将瘤体组织切片放入65°C烤箱中烤2h,然制剂的裂解液于冰上裂解30min,期间每隔5min
后放置在二甲苯中进行脱蜡,随后将切片依次放剧烈震荡30s,共震荡150s,然后经高速离心机
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以12000r/min离心10min,收集上清液到EP管Caspase9mRNA表达水平高于对照组,差异均有统
中,于-80℃冰箱内保存备用;采用BCA检测试计学意义(P<),见图3。WesternBlot结果
剂盒(BicinchoninicacidProteinAssayKit)测定蛋显示,KD组Bax蛋白表达水平高于对照组,Bcl-
白浓度并定量,随后将蛋白与上样缓冲液以1︰32蛋白表达水平低于对照组,差异均有统计学意义
的比例混匀,并煮沸变性;配制好5%浓缩胶、(P<),见图4。
10%分离胶,加入电泳缓冲液,拔出梳子,从左至
右依次加入各组别的30μg蛋白样品,以60V、
300mA电泳至样品到分离胶,后改为以120V、
200mA电泳至溴芬兰到分离胶最下沿;取出分离
胶,并按照海绵垫—三层滤纸—胶—聚偏二***乙
烯膜(polyvinylidenefluoride,PVDF膜)—三层滤
纸—海绵垫的顺序夹好湿法转膜1h;以5%脱脂
奶粉室温封闭1h后,分别加入B淋巴细胞瘤-
2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相
关X(Bcl-2-associatedX,Bax)蛋白抗体
(1︰1000)和GAPDH抗体(1︰1000),在
4℃冰箱内孵育过夜后,经三羟***氨基甲烷盐
酸盐+吐温(Tris-HCl+Tween,TBST)缓冲
液漂洗3次,分别加入山羊抗兔或鼠IgG二抗
(1︰5000),室温孵育1h,再次经TBST缓冲液
注:*表示与对照组比较,P<;DAPI为4',6-二脒
漂洗3次,于暗室中,在膜上滴加增强化学发光液 基-2-苯基吲哚,Apoptosis为细胞凋亡,Merge为融合
(enhancedchemiluminescence,ECL)显影。图2 TUNEL染色检测KD对裸鼠结肠癌皮下成瘤细胞凋亡的影响
统计学处理
采用GraphpadPrism7软件统计分析所有数据,
计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验,P<
。
2 结果
KD对裸鼠结肠癌皮下成瘤的影响
KD组的瘤体重量稍高于对照组,差异无统计
学意义(P>),见图1。
注:*表示与对照组比较,P<;Caspase为半胱氨酸
天冬氨酸蛋白酶
图3 两组瘤体组织中Caspase3和Caspase9mRNA表达
水平的测定
注:*表示与对照组比较,P>
图1 KD对裸鼠结肠癌皮下成瘤的影响
KD对裸鼠结肠癌皮下成瘤细胞凋亡的影响
TUNEL染色结果显示,KD组细胞凋亡率高于
对照组,差异有统计学意义(P<),见图2。
KD对裸鼠结肠癌皮下瘤组织中Caspase3和 注:*表示与对照组比较,P<;GAPDH为甘油醛-3-磷酸
Caspase9mRNA及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响脱氢酶,Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2,Bax为Bcl-2相关X
实时荧光PCR结果显示,KD组Caspase3和图4 两组瘤体组织中Bax和Bcl-2蛋白表达水平的测定
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3 讨论[3]YangY,HanZ,LiX,
KD最初是由RMWilder博士开创并应用于儿factorsofcolorectalcancerinChina[J].ChinJCanc-
童癫治疗的一种组合配方饮食,其安全性已得到erRes,2020,32(6):729-741.
广泛认可。后续研究还证实,KD疗法可用于肥[4]OcvirkS,O',bileacidmetabo-
lismandcolorectalcancer[J].SeminCancerBiol,
胖、各种急慢性炎症、孤独症及肿瘤等疾病的治
2021,73:347-355.
疗中[5-6,10]。例如,清热降脂颗粒结合KD可通过
[5]Ulamek-KoziolM,CzuczwarSJ,JanuszewskiS,et
改善血脂紊乱及降低趋化素和网膜素-1水平进而
[J].Nutrients,
[11]。KD
达到治疗脾虚湿阻型单纯性肥胖的目的对2019,11(10):2510.
2型糖尿病患者的血糖、血脂水平具有良好的控制[6]YancyWSJr,MitchellNS,
[12]
效果。另外,众多研究表明,KD可抑制肿瘤生DietforObesityandDiabetes[J].JAMAInternMed,
长,增强化疗敏感性,延长患者生存期,提高患2019,179(12):1734-1735.
者生命质量,总之,KD目前已被用于多种动物模[7]WlodarczykA,CubalaWJ,
型及临床病例的治疗及辅助治疗中,其机制可能Diet:ADietaryModificationasanAnxiolyticAp-
为肿瘤缺乏利用***体的代谢酶,因此肿瘤细胞无proach?[J].Nutrients,2020,12(12):3822.
法利用***体进行代谢[13-15]。[8]DashtiHM,MathewTC,Al-
本研究将人结肠癌HCT116细胞接种到雄性裸Low-CarbohydrateKetogenicDietintheTreatmentof
鼠皮下,制备裸鼠结肠癌移植瘤模型,并对裸鼠Type2Diabetes[J].MedPrincPract,2021,30(3):
223-235.
予以KD干预,结果显示,干预后,KD组的瘤体
[9]HaoGW,ChenYS,HeDM,
重量虽高于对照组,但差异无统计学意义(P>
ColonCancerCellsinNudeMiceisDelayedbyKetogen-
),表明KD干预可延缓结肠癌瘤体的生长,
icDietWithorWithoutOmega-3FattyAcidsandMedi-
Hao[9]。TUNEL
与等的研究结果相似进一步的染um-chainTriglycerides[J].AsianPacificJournalof
色结果表明,KD可促进瘤体凋亡,且有研究发CancerPreventionApjcp,2015,16(5):2061-2068.
现,KD过程中的中间代谢产物β-羟丁酸可抑制[10]WeberDD,Aminazdeh-GohariS,
HT29、Caco-2结肠癌细胞及C57BL-6小鼠的dietincancertherapy[J].Aging(AlbanyNY),2018,
mTOR信号通路,并上调肠细胞中肠特异性转录因10(2):164-165.
子表达,继而维持小鼠的肠道稳态[16-17],由此表[11]万红,燕树勋,闫诏,***饮
明,KD干预可延缓结肠癌细胞皮下移植瘤瘤体生食对脾虚湿阻型单纯性肥胖疗效及其机制研究[J].
长并诱导瘤体凋亡,改善瘤体病理变化。Bcl-2、中华中医药学刊,2021,39(11):232-235.
Bax为Bcl-2细胞凋亡家族的成员,两者相互作[12]高梅,曹凌瑕,刘卫霞,***饮食对T2DM糖
用,将信号传代给Caspase家族并诱导级联放大,脂代谢和减重影响的Meta分析[J].医学研究杂
,2021,50(7):67-71.
使细胞凋亡,因此,通过调控上述蛋白的表达,志
[13]WeberDD,Aminzadeh-GohariS,TulipanJ,et
可影响肿瘤细胞的存活。本研究结果亦证实了KD
-Wheredo
可通过调控Caspase3和Caspase9mRNA及Bax和
westand?[J].MolMetab,2020,33:102-121.
Bcl-2蛋白表达,继而促进结肠癌瘤体凋亡。
[14]WeberDD,Aminazdeh-GohariS,
综上所述,KD可抑制裸鼠结肠癌移植瘤生dietincancertherapy[J].Aging(AlbanyNY),2018,
长,其是通过提高Caspase3和Caspase9mRNA及10(2):164-165.
Bax蛋白表达水平、降低Bcl-2蛋白表达水平实[15]PlottiF,TerranovaC,LuveroD,
现的。Chemotherapy:TheEffectsofFastingandKetogenic
[参考文献]DietonCancerTreatment[J].Chemotherapy,2020,
[1]BrayF,FerlayJ,SoerjomataramI,(3-4):77-84.
statistics2018:GLOBOCANestimatesofincidenceand[16]WangQ,ZhouY,RychahouP,
mortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].contributestointestinalcelldifferentiation[J].Cell
CACancerJClin,2018,68(6):394-&Differentiation,2017,24(3):458-468.
[2]LiN,LuB,LuoC,,mortality,sur-[17]ZhouY,RychahouP,WangQ,
vival,riskfactorandscreeningofcolorectalcancer:asignalingcontrolsPanethandgobletcelldifferentiation
comparisonamongChina,Europe,andnorthernAmer-intheintestinalepithelium[J].CellDeathDis,
ica[J].CancerLett,2021,522:255-,6:e1631.
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