慢病毒载体构建步骤.pdf

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一、简介
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基
因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢
病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主
染色体上,从而达到持久性表达。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果
差,转移到细胞内的siRNA半衰期短,体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂
的,因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体,然后转
移到细胞内转录siRNA的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达
抑制效果也不逊色于体外合成siRNA,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期
阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒,在周期性和非
周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA,实现在多种类型的细胞
和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和动物细胞组织中快速
而高效地研究基因功能,以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为
siRNA的携带者,不但具备特异性地使基因表达沉默的能力,而且充分发挥了慢病毒载体
自身所具备的优势,为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
在所构建的siRNA表达载体中,是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的,这
是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的RNA不会带polyA尾。当RNA
聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时,它指导的转录就会停止,在转录产物3’端形成1~4个
U。U6和H1RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素
均位于转录区的上游,适合于表达~21ntRNA和~50ntRNA茎环结构(stemloop)。在
siRNA表达载体中,构成siRNA的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链
互补结合形成siRNA;也可由载体直接表达小发卡状RNA(smallhairpinRNA,shRNA),载
体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4~5T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可
折叠成具有1~4个U3’突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前
通常要通过合成siRNA的方法,寻找高效的siRNA,然后从中挑选符合载体要求的序列,
将其引入siRNA表达载体(筛选)。
二、实验流程(大致的简单过程)
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可
提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的:.
病毒颗粒,需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒(购入)同时共转染细胞,在293T细
胞(购入)中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清
液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到
基因组,从而高水平的表达效应分子。
大致的实验流程:
(序列,序列号等),构建含有外源基因或siRNA的重组载
体;(即质粒构建,已构建好,质粒可以永久保存)
,提取和纯化高质量的不含内***的重组质粒;
(购入)共转染293T细胞[1],进行病毒包装和
生产,收集病毒液;
、纯化病毒液;
(293T细胞);
(高精确滴定方法)和Western分析实验结果;
;检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药
物进行稳定转染细胞株的筛选,通常状况下,筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病
毒液足够用于一般的动物活体实验。
三、重组质粒构建流程
:shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中,退火形成双
链,PCR扩增)

:一般做50-100ul体系,然后跑电泳回收,回收量一般为30ul。

原理:首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DN***段,分离目的条带DNA,然后紫外光
下切割含目的DNA条带的胶块,利用胶回收试剂盒回收纯化DN***段。试剂盒的胶回收
柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理,配
备设计独特的离心吸附柱式结构,使用常规台式高速离心机,在几分钟之内即可以高效回收
核酸片段。
实验仪器:1、琼脂糖凝胶电泳系统2、紫外观察分析仪3、离心机4、单面刀片5、恒
温水浴锅
试剂:1、DNA回收试剂盒[2]2、50×TAE[3](电泳缓冲液Tris-乙酸)3、ddHO
2
4、琼脂糖凝胶[4]
步骤:
1)使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳(分离DNA
作用)[5]。
2)在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块,尽可能除去多余的琼脂糖。
中。:.
3)按每100mg琼脂糖加入300—600μl溶胶液[6]的比例加入溶胶液(本实验加500ul),
置55℃水浴10分钟,使琼脂糖块完全溶化,期间每2分钟颠例混匀一次促溶。
4)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱,12000rpm室温离心1分钟,倒掉收集管中的液
体。再将吸附柱放入同一个收集管中。
5)在吸附柱中加入500uI漂洗液,室温静置1分钟后,12000rpm室温离心30秒,倒
掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。
6)再在吸附柱中加入500uI漂洗液,12000rpm室温离心15秒,倒掉收集管中的液体,
将吸附柱放入同一个收集管中。
7)12000rpm室温空离心1分钟。
8),在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液,
室温静置2分钟后,12000rpm室温离心1分钟(为提高回收效率可再洗脱一次),
离心管(DNA)贮存于-20℃。
9)琼脂糖凝胶电泳(鉴定作用)检测回收产物。
注意事项:
1)切胶时应快速操作,在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛;
2)溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏,故尽量放置于暗室,切带时应使用长波
长紫外灯,切胶时间尽量短。
3)胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA的回收率。
4)把洗脱液加热,使用时有利于提高洗脱液效率

器材:旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,,双面离心管架,
台式离心机,干式恒温气浴。
试剂:T载体,T4DNA连接酶,连接酶缓冲液,无菌ddWater。
操作步骤:PCR产物(已纯化回收)与T载体直接连接:
(1)事先将干式恒温仪(或冰盒里的水)温度设定在14~16°C。
(2)取4个灭菌的200ul微量离心管,加入:(需要调整)4ml目的基因;1mlT
载体;(TAKARA,350U/ul);1ml连接酶缓冲液10xbuffer;
,总量10ml体系。
(3)上述混合液轻轻震荡后再短暂离心,然后置于14°C干式恒温仪(或14°C
水中)中保温过夜(12-16h)。
(4)连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。

原理:目前,感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗
CaCl溶液在低温(0℃)时处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成
2
球形,外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,
通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下,经过连接后的DN***段与感受态
细胞混合保温,可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的DNA分子通过复制、表达,实现
遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培
养,即可筛选出转化体,即带有异源DNA分子的受体细胞。
目的:连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增,然
后提取质粒。
器材:恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,
制冰机,分光光度计,微量移液枪。:.
试剂:[7]
液。
大肠杆菌感受态细胞制备步骤:
1)从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB液体培养基,37℃振荡培养过夜(12h
左右),直至对数生长期。
2),37℃振荡培养2~3h,至OD600值达到
-。
3)菌液转移到50ml离心管中,冰上放置10min。
4)4℃离心10min(4000r/min)
5)倒出培养液,将管口倒置以便培养液流尽
6)***化钙10ml悬浮细胞,立即冰浴30min
7)4℃离心10min(4000r/min)
8)倒出上清液,***化钙2ml悬浮细胞(冰上放置)
9)分装细胞,200ul一份,4℃保存。暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。取其中一
份进行转化。
质粒DNA的转化
1)取200ul新鲜制备的感受态细胞,加入质粒DNA2ul混匀,冰浴30min
2)离心管放到42℃水浴锅中保温90s(90s一定要精确,不要摇动试管)
3)将试管迅速转移到冰浴,冷却1-2min
4)每管加800ulLB液体培养基,37℃培养1h
5)取适当体积(100ul)的复苏细胞,涂布在含有适当抗生素的LB固体培养基上,用
灭过菌的玻璃棒涂布均匀,室温正置30min
6)倒置平皿37℃,12~16h,出现菌落
为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素:
:细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液
的OD600来控制。
:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般
情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(.),并用超纯水配
制,最好分装保存于干燥的冷暗处。:.
:整个操作过程均应在无菌条件下进行。
(碱裂解法提取质粒DNA)
原理:本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阴
离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性。
1)用SDS处理细菌后,会导致细菌细胞破裂,释放出质粒DNA和染色体DNA。两种
DNA在强碱环境都会变性。
2),质粒DNA将迅速复性,而染色体
DNA分子巨大,难以复性。
3)通过离心,大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质沉淀(SDS的作用下)
除去,而质粒DNA留在上清中。
4)再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤,可得到纯化的质粒DNA。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如,
***化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,
但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、***仿抽提,RNA酶消
化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转
化、DN***段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常
用。
试剂:
Ⅰ:50mM(mmol/L)葡萄糖,25mMTris-HCl(),10mMEDTA()。
1MTris-HCl(),()10ml,,加ddH2O至500ml。
在10lbf/in2高压灭菌15min,贮存于4℃。
Ⅱ:,1%SDS。2NNaOH1ml,10%SDS1ml,加ddH2O至10ml。
使用前临时配置(NaOH作用是使细胞裂解)。
Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,。5MKAc300ml,,加ddH2O
至500ml。4℃保存备用。
:10mMTris-HCl(),1mMEDTA()。1MTris-HCl()1ml,
EDTA(),加ddH2O至100ml。15lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用。
/***仿/异戊醇(25:24:1)
(无水乙醇、70%乙醇)
×TBE:Tris碱54g,,EDTA-Na2·,加ddH2O至1000ml。15
lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用。
(EB):10mg/ml
(RNA酶A):不含DNA酶(DNase-free)RNaseA的10mg/ml,TE配制,沸
水加热15min,分装后贮存于-20℃。
×loadingbuffer(上样缓冲液):%溴酚蓝,%二甲苯青FF,40%(W/V)蔗
糖水溶液。
%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,×TBE,微波炉加热至完
全溶化,冷却至60℃左右,加EB母液(10mg/ml)(注意:EB为强诱变
剂,操作时带手套),轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却
30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中(×TBE),即可上样。
仪器:(1)塑料离心管架(30孔);(2)10、100、1000µL微量加样器;(3)
心管(又称EPPendorf离心管);(4)低温高速离心机(20000r/min)一台;(5)无菌工作台
(6)高压锅,(7)常用玻璃仪器及滴管等。
质粒提取步骤::.
,(含相应抗生素)液体培养基中,
37℃、250g振荡培养过夜(约12-14hr)。
,室温离心8000g×1min,弃上清,将离心管倒置,使液体
尽可能流尽。
Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(),10mM
EDTA())中,剧烈振荡,使菌体分散混匀,(且不至于沉淀)。
Ⅱ,颠倒数次混匀(不要剧烈振荡),并将离心管放置于冰上
2-3min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清)。
Ⅲ(醋酸甲AcK),将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可
在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变
性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
/***仿/异戊醇,振荡混匀,4℃离心12000g×10min。没有用PDS沉淀
干净的蛋白质置于下层
,,混匀,室温放置
2-5min,4℃离心12000g×15min。
%乙醇洗涤沉淀1-2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将沉淀在室温下晾
干。
(含RNaseA20μg/ml),37℃水浴30min以降解RNA分子,-20℃保存
备用。

1)通过PCR方法鉴定:以重组质粒为模板,PCR产物的特异性引物或载体的通用引物进
行PCR扩增后电泳鉴定。
2)酶切鉴定:双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了

实验材料:质粒DNA
仪器:(1)稳压稳流电泳仪(2)可调微量移液器(3)水平电泳槽(4)紫外分光光度计
(5)紫外透射仪等
试剂:(1)电泳缓冲液:Tris-硼酸(1×TBE)。(2)加样缓冲液(6×):%
溴酚蓝,40%蔗糖(3)溴化乙锭(EB)溶液:10mg/ml
含量测定:紫外吸收法溴化乙锭荧光强度法
纯度鉴定:紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳
测定DNA浓度的方法有两种:
紫外光吸收法:核酸在260nm处具有强吸收峰,所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA
进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此,一般在中
性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。
溴化乙锭荧光强度法:当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时,会影响紫外光吸收值的测
定,这时,可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度,因为
这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。
测定质粒DNA纯度的方法
琼脂糖凝胶电泳
四、慢病毒包装流程

、细胞株:293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基
为DMEM[8](含10%FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。:.
、菌株:大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
、病毒载体系统组成
a)pGC-LV重组载体(已制备好的);b);c)
DNA溶液的制备(见上面具体步骤):质粒DNA溶于除菌的TE中,以紫外光吸收法
测定其浓度及纯度,保证所提质粒DNA的A260/~。
、试剂
台盼兰、胎牛血清FBS、DMSO、DMEM、胰酶、Lipofectamine2000
、仪器
荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜、Plus-20离心超滤装置

、活细胞计数(台盼蓝染色)
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000个/ml(一般稀释倍数为100倍),
%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板
计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。
、细胞株的冻存
~3天生长旺盛的细胞,用细胞培养液将细胞配成2×106~2×107/ml。
,***亚砜
[9](或甘油),混匀后密封。置4℃1小时,-20℃2小时,然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽
上过夜后浸入液氮中。
、细胞复苏
,应带有防护眼睛和手套。
℃水的水浴中,并不时摇动,尽快解冻。
%酒精擦拭消毒后,移至净化台上,吸出细胞悬液至培养瓶中,补加3ml含
10%FBS(胎牛血清)的DMEM培养基,置温箱培养。
。
、细胞传代
,加入5ml灭菌PBS溶液,轻轻晃动,洗涤细胞生长面,然后弃去
PBS溶液。
,消化1-2min直到细胞完全消化下来。
%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM培养基5ml,用刻度吸管吹打数
次,将瓶壁上的细胞冲洗下来。
,继续培养。

细胞转染
1)转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整
,重新接种于15cm细胞培养皿,37℃、5%CO2培养箱内
培养。24h待细胞密度达70%~80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要,
因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。
3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg,
体15μg,),与相应体积的Opti-MEM[10]混合均匀,调整总体积为
,在室温下温育5分钟。
4)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀,取100μlLipofectamine2000试剂在另一管中
-MEM混合,在室温下温育5分钟。:.
5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合,轻轻地颠倒混匀,不要
振荡。必须在5分钟之内混合。
6)混合后,在室温下温育20分钟,以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转
染复合物。
7)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中,混匀,于37℃,
5%CO2细胞培养箱中培养。
8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基,每瓶细胞加入20ml的PBS液,轻轻左
右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物,然后倒去。
9)每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml,于37℃、5%CO2培养箱内
继续培养48小时。

(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液。
℃,4000g离心10min,除去细胞碎片。
。
(最多19ml),盖上盖子。将过滤杯插到滤过
液收集管中。
,做好平衡,放在转头上。
×g离心,至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。
,取出离心装置,将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。
。
,时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把离心杯从样品
收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
,分装后保存在病毒管中,-80度长期保存。取其中一支进行
病毒生物学滴度测定。

1)孔稀释法测定滴度
,为测定滴度所需的细胞(英茂盛业公司用的293T细胞:贴壁生长)
铺板,96孔板,每个孔加4×104个细胞,体积为100μl。
,准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的无血清
培养基。
,混匀后,取10μl加入到第二个管
中。继续相同的操作直到最后一管。
,吸去90μl培养基,丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。
放入培养箱培养。
,加入完全培养基100μl。小心操作,不要吹起细胞。
,观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
说明:
第一个Ep管中加入10ul病毒原液,记为1E+1μl;
第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释,所得病毒原液为第一个Ep中的1/10,记为1E+0μl;
第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释,所得病毒原液为第二个Ep中的1/10,记为1E-1μl;
依次类推…
第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释,所得病毒原液为第六个Ep中的1/10,记为1E-5μl;
第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释,所得病毒原液为第七个Ep中的1/10,记为1E-6μl;
:.
2)Realtime定量PCR法测定滴度
样品制备
,对293T细胞传代,每个24孔中加1×105个细胞,体积为500l;
,准备7~10个无菌的Ep管,在每个管中加入90μl的培养基(DMEM+10%
FBS);
,混匀后,取10μl加入到第二个管
中。继续相同的操作直到最后一管;
,吸去90μl培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入37℃5%CO2
培养箱中培养;
,加入新鲜培养基500μl。小心操作,不要吹起细胞;
,抽提RNA准备做RT-qPCR。
总RNA抽提
说明:根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明书进行,均为RNase-free操作。
,每孔加入1mlTRIZOL吹打,室温静置5min,
ml移液管中。
µl***仿,用力震荡15s,室温静置15min。
℃,12000rpm,离心15min。
。加入等体积-20℃预冷的异丙醇,混
匀后-20℃沉淀10min。
℃,12000rpm离心10min后,去上清。
℃预冷的75%乙醇,洗涤沉淀及离心管壁。
℃,10000rpm离心5min,弃上清。
℃,10000rpm再次离心5min,吸去残液,室温干燥(不需完全干燥)。
µlRNase-free水[11],至完全溶解,紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
五、慢病毒感染目的细胞
慢病毒感染目的细胞预实验注意事项
,需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞
(HEK293T,Hela)作为平行实验的对照细胞。
,可以用完全培养基(培养目的细胞用)稀释;理论上,含
有血清,双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞。加入puromycin[12]可以筛选稳定表达shRNA
的细胞系。
puromycin最优浓度筛选:
每种细胞对puromycin的敏感性不同,因此,准备建立稳定细胞系之前,需要确定能
够在3-5天杀死细胞的最优puromycin浓度。方法如下:
,约2x105/孔,共十孔,CO2孵箱过夜培养。
,观察细胞密度为80%-90%融合。稀释puromycin至培养基,按照从1µg/ml
到10µg/ml,每隔1µg/ml递增的浓度,加至培养孔内。:.
,每隔一天换一次培养基,最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的
浓度。
慢病毒感染细胞和稳定细胞系筛选
第一天:在60mm培养皿内种植细胞,细胞密度为第二天细胞融合能达到70%-80%,
CO2孵箱过夜培养。
第二天:准备3ml培养基,加入Polybrene[13],终浓度为8µg/ml。将步骤五制备的
,轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基,加入含
病毒培养基(Polybrene能够增加病毒感染的效率,然而,有时候Polybr