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doi:.1001-·论 著·
EpothiloneD对体外培养的BTBR小鼠皮质神经元
兴奋性突触结构的影响*
陈永红1杨桦1#刘永峰1雷强2蔚洪恩1△
(山西医科大学,1第五临床医学院神经内科,2基础医学院,太原030012)
摘要目的:探讨微管稳定剂埃博霉素D(EpoD)对孤独症谱系障碍BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构的影
响及机制。方法:体外培养BTBR小鼠原代大脑皮质神经元,免疫荧光法检测所培养神经元的纯度;培养至相对
成熟的BTBR小鼠皮质神经元随机分为实验组(EpoD组)、溶剂对照组(%DMSO)干预24h,再冷处理90
min后行微管免疫荧光染色,观察微管的形态变化;免疫印迹检测微管稳定的标志蛋白(acetyl-tubulin、α-tubulin)、
微管相关蛋白(MAP2、STOP)的表达,及兴奋性突触结构前、后膜标志蛋白(VGLUT1、PSD95)、兴奋性谷氨
酸受体相关蛋白(GluN2B、mGluR5)的表达水平。结果:与对照组相比,10nmol/L的EpoD可增加BTBR小鼠
皮质神经元微管的冷稳定性及微管稳定的标志蛋白、微管相关蛋白的表达;可以增加BTBR小鼠皮质神经元兴奋
性突触结构、兴奋性谷氨酸受体相关蛋白的表达,差异均有统计学意义。结论:微管稳定剂EpoD能改善体外培
养的BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构,其机制可能与增加微管稳定性有关。
关键词皮质神经元;兴奋性突触;埃博霉素D;孤独症谱系障碍;BTBR小鼠
EffectofepothiloneDonexcitatorysynapticstructureofBTBR
mousecorticalneuronsinvitro*
ChenYonghong1,YangHua1#,LiuYongfeng1,LeiQiang2,WeiHongen1△
(,TheFifthClinicalMedicalCollege,
,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030012,China)
AbstractObjective:ToinvestigatetheeffectandmechanismofmicrotubulestabilizerEpothiloneDonthe
:The
primarycerebralcorticalneuronsofBTBRmousewereisolatedandcultured,andthepurityofculturedneurons

anexperimentalgroup(epothiloneDgroup)andavehiclecontrolgroup(%v/vDMSO)for24hintervention.
Aftercoldtreatmentfor90min,themorphologicalchangesofmicrotubuleswereobservedbymicrotubule
-tubulin,α-tubulin,
MAP2,STOP,VGLUT1,PSD95,:Comparedwiththecontrolgroup,
thecoldstabilityofmicrotubulesincorticalneuronofBTBRmousewasincreasedwith10nmol/LEpothiloneD.
Theexpressionsofexcitatorysynapse-relatedandexcitatoryglutamatereceptor-relatedproteinsofcorticalneurons
:ThemicrotubulestabilizerepothiloneDcanimprovetheexcitatory
synapticstructureofcorticalneuronsinBTBRmouseinvitro,whichmayberelatedtotheincreaseofmicrotubule
stability.
Keywords corticalneuron;excitatorysynapse;epothiloneD;autismspectrumdisorder;BTBRmouse
孤独症谱系障碍(autismspectrumdisorder,ASD)是一种神经发育障碍性疾病,患病率呈逐年
上升趋势,其病因和发病机制尚未阐明。兴奋性突
*国家自然科学基金(81671364);山西省卫生健康委员会科研项目触的发育和功能是脑发育过程中的重要事件,研究
(2020TD25,2020XM32,2020RC09)表明突触功能障碍参与了ASD的发病机制[1]。微
:
第1作者E-******@,参与调节神经元和
#共同第1作者,E-mail:******@
[2]
△大脑发育的所有过程,微管的稳定性对神经元突
通信作者,E-mail:hongen.******@
[3-4]
收稿日期:2021-11-13;修回日期:2022-01-25触发育起着重要作用。研究表明ASD的发病与
— 222 —— 223 —
微管的稳定性有着密切的联系[5]。微管稳定剂埃博细胞纯度计数:高倍镜下每张爬片随机选取
霉素D(epothiloneD,EpoD)具有促进微管蛋白5个视野,进行免疫荧光阳性细胞计数。分别计数
聚合和微管装配的作用,可以减轻STOP基因敲除MAP2阳性的神经元细胞数,以及经DAPI染核的
小鼠的行为缺陷和改善突触功能异常[6]。据此,本细胞总数。每个视野下细胞的纯度=阳性细胞数/
研究拟探讨微管稳定剂EpoD对体外培养的ASD细胞总数×100%。重复5次。

及机制,以期为ASD的治疗提供新的理论基础和将培养至相对成熟(10d)的皮质神经元随机
药物靶标。分为实验组和溶剂对照组,实验组给予10nmol/L
EpoDDMSO溶解、溶剂对照组给予相同体积的
1材料和方法
%DMSO溶剂,于培养箱培养24h后移除含药
,用加热的无血清培养基清洗3次,
BTBR小鼠(购自南京大学模式动物研究所,后评估微管形态,检测微管稳定标志蛋白、微管相
饲养于山西省人民医院实验动物中心);埃博霉素关蛋白、兴奋性突触结构相关蛋白及兴奋性谷氨酸
D(MedChemExpress公司);DMSO(索莱宝公司);受体蛋白的表达水平。
Neurobasal培养液、DMEM高糖培养基、
因子B27、青霉素-链霉素、%胰酶、胎牛血对培养至10d的小鼠皮质神经元随机分为实
清及胎马血清(美国Gibco公司);多聚-D-赖氨酸验组、对照组各2组,分别经10nmol/LEpoD和
氨溴酸盐(美国Sigma公司);SDS-PAGE凝胶制相同体积的溶剂干预后,吸弃条件培养基,加热的
备试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒(BOSTER公司);无血清培养基清洗3次。一组继续保持于培养箱37
抗MAP2、STOP、α-tubulin、PSD95、GluN2B、℃,90min,另一组给予4℃冷处理90min,后迅
mGluR5抗体(CST公司);抗acetyl-tubulin抗体速细胞固定,进行兔抗α-tubulin抗体(1∶100)免
(美国Sigma公司);抗VGLUT1抗体(Synaptic疫荧光染色标记微管,倒置荧光显微镜下观察微管
Systems公司);抗GADPH抗体(Bioworld公司);形态,考察神经元在冷处理干预下的稳定性,并比
羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(EarthOx公司);FITC羊较微管稳定剂EpoD干预后微管稳定性的变化。
抗兔IgG(ABclonal公司)。
、对照组给予相
取孕15~16d孕鼠脱臼处死,无菌条件下快速同体积溶剂干预24h后,评估微管稳定标志蛋白、
取出胚胎置于解剖液中,在体视显微镜下解剖分离微管相关蛋白、兴奋性突触结构相关蛋白及兴奋性
且剥除脑膜和血管,将大脑皮质组织置于培养皿中,谷氨酸受体蛋白的表达水平。后裂解细胞提取总蛋
胰酶消化,吸管反复轻柔吹打组织团块,用细胞筛白,采用BCA法检测蛋白浓度,每孔上样40μg蛋
分散成单细胞悬液,计数、铺板,调节细胞浓度,白质行凝胶电泳,电泳完成后进行电转将蛋白转
取适量细胞接种于经多聚赖氨酸包被的培养皿,放移至PVDF膜,5%奶粉封闭,然后用一抗acetyl-
入37℃、5%CO2培养箱中培养,4h后换液,培养tubulin(1∶5000)、α-tubulin(1∶1000)、MAP2(1∶
液换成含B27、青霉素-链霉素和L-谷氨酰***的无1000)、STOP(1∶750)、PSD95(1∶1000)、
血清Neurobasal培养基,以后每3天半量换液,培VGLUT1(1∶4000)、GluN2B(1∶1000)、
养10~14d。mGluR5(1∶1000)、GAPDH(1∶10000)孵育过夜,
(1∶20000)孵育lh,PVDF膜置
观察神经元的生长状态,培养至7d皮质神经于凝胶成像分析系统中,均匀滴加显影剂,显影。
元已成熟,胞体饱满,可用于鉴定。4%
固定30min,%TritonX-100作用20min,5%使用ImageJ软件、
BSA封闭20min,加入抗MAP2抗体(1∶100)印迹图像进行分析,
于4℃孵育过夜,次日加入FITC标记的荧光二抗软件分析,所有计量资料结果均以x±s表示。两
(1∶100)于37℃避光孵育1h,二抗孵育结束后,组之间的差异性比较采用t检验,取a=
加入DAPI染液避光孵育15min,抗荧光衰减剂封水准,P<。
片,后共聚焦显微镜观察并拍照。
— 222 —— 223 —
MAP2进行免疫荧光染色,共聚焦显微镜拍摄观察
2结果
染色结果。观察可见,细胞经MAP2特异性染色和
,细胞在显微镜下细胞体和
倒置相差显微镜下观察大脑皮质神经元生长突起呈现绿色荧光、细胞核呈现蓝色荧光,蓝色荧
形态变化(图1),接种培养2d后大部分神经元伸光的细胞核大部分位于绿色荧光的细胞体中央。计
出突起,胞体多呈锥形,细胞突起之间、突起与胞数结果显示神经元纯度可达到70%以上,且生长
体之间开始形成少量连接(图1A);培养至4d可状态良好,可用于后续实验。
见大脑皮质神经元细胞体积变大,突起生长增多,
胞体饱满,细胞间形成疏散的神经网络结构(图结果显示(图3),在正常的皮质神经元细胞中,
1B);培养至5d后,神经元胞体变大,突起连接形α-tubulin染色均匀地分布在神经元胞体、突起中,
成的网状结构也更加明显(图1C);培养至7d神当经过低温刺激后,显示在EpoD组小鼠皮质神经
经元突起分支明显延长,胞体更加饱满,形成紧密元细胞中微管能抵抗低温刺激,α-tubulin染色未见
的神经网络(箭头所示),大脑皮质神经元成熟,明显变化。相反,在溶剂对照组小鼠皮质神经元细
可用于后续实验(图1D)。胞中,α-tubulin的均一性染色消失,神经元突起中
,出现广泛
选取培养7d的大脑皮质神经元进行免疫荧光的微管解体。
染色鉴定(图2),通过对神经元特异性标志蛋白
溶剂对照组EpoD组
2d4d
37℃
5d7d
℃
4
13
DAPIMAP2Merge
2
图1倒置相差显微镜观察,原代培养的BTBR胎鼠大脑皮质神经元2~7d的形态学变化。红色标尺=100µm,白色标尺=50µm.
图2免疫荧光鉴定原代培养胎鼠大脑皮质神经元纯度:MAP2(神经元特异性标志蛋白)、DAPI非特异性标记细胞核。图片中杂细胞细
胞核较少,神经元纯度>70%。标尺=100µm.
图3BTBR胎鼠皮质神经元微管的形态变化,一组保持在37℃,另一组暴露在低温(4℃,90min)中。微管用α-tubulin(绿色)标记。
标尺=50µm.
— 224 —— 225 —

PSD95

达结果显示(图4),与溶剂对照组相比,EpoD溶剂对照组EpoD组
实验组acetyl-tubulin、α-tubulin和STOP蛋白表达VGLUT1
,(,
水平显著升高差异有统计学意义P<<GAPDH
)。MAP2蛋白差异无统计学意义。溶剂对照组EpoD组
8
Acetyl-tubulin溶剂对照组
EpoD组
GAPDH
6
溶剂对照组EpoD组
α-tubulin4
GAPDH
相对表达量
溶剂对照组EpoD组2
**
STOP
0
GAPDH
PSD95
溶剂对照组EpoD组VGLUT1
MAP2图5免疫印迹检测EpoD干预后BTBR小鼠原代皮质神经元
突触结构相关蛋白PSD95和VGLUT1蛋白的表达
GAPDH**P<
溶剂对照组EpoD组
4GluN2B
溶剂对照组GAPDH
EpoD组
溶剂对照组EpoD组
3
mGluR5
GAPDH
***
2溶剂对照组EpoD组
相对表达量
**
溶剂对照组

EpoD组*
*

0

STOPMAP2
-tubulin

Acetyl-tubulin相对表达量

图4免疫印迹检测EpoD干预后BTBR小鼠原代皮质神经元
、、和蛋白的表达
acetyl-tubulinα-
*P<,**P<
GluN2BmGluR5

图6免疫印迹检测EpoD干预后BTBR小鼠原代皮质神经元
显示(图5),与溶剂对照组相比,EpoD实验兴奋性谷氨酸受体GluN2B和mGluR5蛋白的表达
*
组PSD95蛋白表达水平升高,差异有统计学意义P<
(P<);VGLUT1蛋白表达差异无统计学意义。
(图阶段即表现出的基于2大领域的损害:持续的社会
6),与溶剂对照组相比,EpoD实验组GluN2B蛋交流和社会交往障碍;限制性的兴趣和重复行为,
白和mGluR5蛋白表达水平均升高,差异有统计学通常伴随着感觉异常和语言发展的延迟或缺失[7]。
意义(P<)。ASD患者社会适应差,生活不能自理,需要终身
照顾,给社会和家庭带来巨大的经济和精神负担。
3讨论
虽然遗传和环境因素及其相互作用被普遍认为与
ASD是一种神经发育障碍性疾病,是自幼儿ASD的发病有关,但其确切的病因和发病机制仍
— 224 —— 225 —
不清楚,仍缺乏有效的治疗方法和预防措施[8]。目微管稳定的标志蛋白、微管相关蛋白的表达;可以
前对ASD的研究大多基于整体动物模型。本研究增加BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构、兴奋
以体外培养的ASD模型BTBR小鼠皮质神经元为性谷氨酸受体相关蛋白的表达(图7)。本研究结
研究对象,通过给予微管稳定剂EpoD对ASD可果进一步验证了微管稳定性在ASD发病机制中的
能的发病机制进行了初步探索。研究结果表明Epo重要作用,为ASD的治疗提供了新的可能。
D可增加BTBR小鼠皮质神经元微管的冷稳定性及
图7微管稳定剂EpothiloneD对孤独症谱系障碍BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构的影响及机制
Microtubules:微管;DIV:dayinvitro体外培养日;pre-synapticneuronaxon:突触前神经元轴突;
post-synapticneuron:突触后神经元;dendrite:树突;spinehead:树突棘头;spineneck:树突棘颈
稳定的微管可以抵抗解聚条件,如寒冷刺激和在实验中所采用的剂量和作用时间[16]。高浓度时,
一些解聚药物[9]。微管功能障碍是神经精神疾病的微管稳定剂高度稳定微管并干扰其正常破坏,是靶
共同特征,这可能导致了神经精神疾病的发生[10]。向和治疗各种类型恶性肿瘤的手段之一。然而,在
靶向微管药物的研究正在成为治疗各种神经精神疾低浓度时这些药物可以稳定足够的微管,以防止它
病(如帕金森氏病、阿尔茨海默病和精神分裂症)们去极化和溶解,甚至促进它们的极化,这对于脑
的一种策略[11-14]。研究表明,细胞骨架和微管稳定损伤的治疗非常重要[17]。10d的原代皮质神经元
性在ASD的发病机制中起着重要作用[5]。微管相被认为是相对成熟的,突触蛋白、谷氨酸受体、轴
关蛋白(MAPs)是一类结合和稳定微管的蛋白质,突/树突连接的增加和电生理特性的改变在这一时
MAPs可以稳定微管,这被认为是神经元回路的发间段发生[16]。因此,本研究选择10d的BTBR小
育、维持和功能所必需的[4]。其中MAP6(也称为鼠原代皮质神经元作为研究对象。Acetyl-tubulin
STOP蛋白)是一种钙调节蛋白,负责神经元微管是一种广泛应用的稳定聚合微管的标记物,在稳定
的高度稳定以及神经元结构和突触可塑性的建立,的微管中,α-tubulin在赖氨酸-40位点发生乙酰化,
被认为与神经元微管对寒冷刺激和药物的稳定性相反之,α-tubulin在非聚合微管中迅速去乙酰化[17]。
关[15]。研究表明与对照组相比,ASD患者血浆和本研究结果表明,EpoD可提高BTBR小鼠大脑皮
BTBR小鼠大脑皮质中的STOP显著减少[1,15]。这质神经元微管的冷稳定性,可增加微管稳定的标志
些结果提示STOP基因与ASD发病有关。蛋白和微管相关蛋白的表达。
EpoD是一种天然存在于纤维素黏杆菌中的化兴奋性突触的发育和功能在ASD的发病机制
合物,可以促进微管形成和稳定,抑制微管解聚,中起着重要作用[1]。VGLUT1作为兴奋性突触前膜
并且很容易透过血脑屏障,这使其广泛应用于神经标志物,对于兴奋性神经递质传递和正常突触功能
精神疾病的治疗[10]。EpoD具有广泛的效果,这取必不可少[18-19]。PSD-95是兴奋性神经元中突触后
决于其所针对的疾病、涉及的细胞类型以及药物致密物中重要的支架蛋白,调节谷氨酸的运输和定
— 226 —— 227 —
位,参与突触的发育和可塑性[20]。谷氨酸是最重2020,21(19):7354.
[11]CartelliD,CasagrandeF,BuscetiCL,
要的兴奋性神经递质之一,通过与谷氨酸受体结合
alterationsoccurearlyinexperimentalparkinsonismandthe
[21]。,
而引起兴奋性突触传递研究表明兴奋性和microtubulestabilizerepothiloneDisneuroprotective[J].SciRep,
抑制性突触之间的失衡导致大脑功能障碍,并参与2013,3:1837.
ASD的病理过程[21-22]。BTBR小鼠大脑皮质的谷氨[12]BrundenKR,ZhangB,CarrollJ,
microtubuledensity,axonalintegrity,andcognitioninatransgenic
酸释放水平低于B6小鼠,而STOP基因敲除小鼠
mousemodeloftauopathy[J].JNeurosci,2010,30(41):13861-
的突触囊泡密度较低,释放到突触间隙中的谷氨酸13866.
[21,23]
也较少。本研究结果表明,10nmol/LEpoD[13]ZhangB,CarrollJ,TrojanowskiJQ,-
可使BTBR小鼠皮质神经元中兴奋性突触结构相关stabilizingagent,epothiloneD,reducesaxonaldysfunction,
neurotoxicity,cognitivedeficits,andAlzheimer-likepathology
蛋白、谷氨酸受体蛋白的表达水平增加。
inaninterventionalstudywithagedtautransgenicmice[J].J
综上所述,微管稳定剂EpoD能改善体外培养Neurosci,2012,32(11):3601-3611.
的ASD模型BTBR小鼠皮质神经元的兴奋性突触[14]XiongTQ,ChenLM,GuiY,
结构,其机制可能与增加微管的稳定性有关,有望Donmicrotubuledegradationanddelayedneuronaldeathinthe
hippocampusfollowingtransientglobalischemia[J].JChem
成为治疗ASD的有效药物。
Neuroanat,2019,98:17-26.
[15]WeiH,MaY,LiuJ,
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