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JournalofHainanMedicalUniversity
DOI:./..
网络出版地址:/..R....html
基于GC-MS代谢组学的醒脑静注射液干预脑缺血再灌注大鼠模型的
作用机制研究
刘浩琦,张涵莱,,李媛媛,宋珂,安娜,王丽琴,孙逸坤,高永红
(.中医内科学教育部和北京市重点实验室,北京中医药大学东直门医院,北京;.中国中医科学院针灸研究所,北京
)
[摘要]目的:探讨醒脑静注射液对大鼠脑缺血再灌注模型的保护作用与其代谢途径及机制。方法:线
栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型,模型评价成功后随机分为模型组和醒脑静组各只,假手术组只进行血
管分离不进行栓线,醒脑静组给予腹腔注射,模型组和假手术组给予同剂量的生理盐水,每日次。d后使
用HE染色法与GC-MS代谢组学技术检测大鼠脑组织中内源性代谢物的变化情况。采用主成分分析
(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)筛选出差异代谢物并对代谢途径进行分析。结果:大鼠脑
缺血再灌注损伤后,内源性代谢物紊乱。从模型组和假手术组中筛选出种差异代谢物,其中种下调,
种上调。经醒脑静组与模型组筛选,得出种差异代谢物,其中种下调,种上调。通过对分析代谢产物
的差异,得出醒脑静注射液干预大鼠脑缺血再灌注后代谢的途径涉及氨基酸代谢(β-丙氨酸代谢、丙氨酸、
谷氨酸和天冬氨酸代谢、组氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢)、谷胱甘肽代谢、嘧啶代谢、ABC转运体、氮代谢
等代谢途径。结论:醒脑静注射液可使脑缺血再灌注大鼠的代谢物水平有不同程度的恢复,主要通过氨基
酸代谢、ABC转运蛋白、谷胱甘肽代谢等代谢途径对大鼠脑缺血再灌注损伤进行调节。
[关键词]醒脑静注射液;脑缺血再灌注;代谢组学;GC-MS
[中图分类号]R.[文献标识码]A[文章编号]-()--
MechanismofXingnaojinginjectioninterventionincerebralischemia-reperfusionratmodel
basedonGC-MSmetabolomics
LIUHao-qi,ZHANGHan-lai,,LIYuan-yuan,SONGKe,ANNa,WANGLi-qin,SUNYi-kun,
GAOYong-hong
(.KeyLaboratoryofChineseInternalMedicineofMinistryofEducationandBeijing,DongzhimenHospitalAffiliatedtoBeijing
UniversityofChineseMedicine,Beijing,China;.InstituteofAcupunctureandMoxibustion,ChinaAcademyofChineseMedical
Sciences,Beijing,China)
[FoundationProject]:ThisstudywassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina()
[Author]:LIUHao-qi,,E-mail:******@.com;ZHANGHan-lai,.,E-mail:******@.com.
[Correspondenceto]:GAOYong-hong,.,Researcher,E-mail:******@.com.
Received:‑⁃‑⁃Revised:‑⁃‑⁃JHMU,;():‑‐⁃
Viewfromspecialist:Itiscreative,andofcertainscientificandeducationalvalue.
[ABSTRACT]Objective:ToinvestigatetheprotectiveeffectofXingnaojinginjectiononcerebralischemia-reperfusioninrats
:Thecerebralischemiareperfusionmodelofratswasestablishedbysutureoc‑‐⁃
,theratswererandomlydividedintomodelgroupandXingnaojinggroupwitheightrats
,
wasgivenintraperitonealinjection,modelgroupandshamoperationgroupweregiventhesamedoseofnormalsaline,twicea
,HEstainingandGC-MSmetabolomicswereusedtodetectthechangesofendogenousmetabolitesinthe
[基金项目]国家自然科学基金资助项目()
[作者简介]刘浩琦,硕士在读,E-mail:******@.com;张涵莱,博士,E-mail:******@.com。
[通讯作者]高永红,博士,研究员,E-mail:******@.com。
[收稿日期]--[修回日期]--网络出版时间:--::
圜万方数据
‑‐⁃MS代谢组学的醒脑静注射液干预脑缺血再灌注大鼠模型的作用机制研究
(PCA)andorthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis(OPLS-DA)were
:Endogenousmetabolitesweredisturbed
aftercerebralischemia--onedifferentmetaboliteswerescreenedfromthemodelgroupandthe
shamgroup,ofwhichthreeweredown-regulatedandsixty-eightwereup--eightdifferentmetaboliteswerefound
betweenXingnaojinggroupandshamoperationgroup,amongwhicheightweredown-regulatedandeightywereup-‑‐⁃
terscreeningofXingnaojinggroupandmodelgroup,twelvedifferentmetaboliteswereobtained,amongwhichsevenweredown-
regulatedandfivewereup-,Xingnaojinginjectionwasconsideredtobein‑‐⁃
volvedinthemetabolicpathwayaftercerebralischemia-reperfusioninrats,includingaminoacidmetabolism(betaalaninemetabo‑‐⁃
lism,alanine,glutamicacidandasparticacidmetabolism,histidinemetabolism,arginineandprolinemetabolism),glutathione
metabolism,pyrimidinemetabolism,ABCtransporter,:Xingnao‑‐⁃
jinginjectioncanrestorethelevelsofmetabolitesincerebralischemia-reperfusionratsincertaindegrees,mainlythroughaminoac‑‐⁃
idmetabolism,ABCtransporter,glutathionemetabolismandothermetabolicpathwaystoregulatecerebralischemia-reperfusion
injuryinrats.
[KEYWORDS]Xingnaojinginjection;Cerebralischemia-reperfusion;Metabolomics;GC-MS
脑卒中因其较高的发病、
临床中的常见病。在脑卒中疾病中,急性缺血性脑醒脑静注射液(无锡济民可信山河药业股份有
卒中占脑卒中疾病的%~%[]。脑缺血损伤的限公司,国药准字Z),栓线(北京西浓科技
发生是一个复杂的过程,其中包含炎症反应、自由有限公司,-A),医用真丝编织线(上海浦东金
XS
基损伤与细胞凋亡等[]。代谢组学是能诠释疾病的环医疗用品股份有限公司,-),石蜡切片机、组
Leica/
病理生理过程并能寻找与疾病相关的诊断标志物织包埋机、组织冷台、组织展片机(德国),黏
或预后生物标志物的一种技术。醒脑静注射液由附载玻片(福州迈新生物技术有限公司),光学显微
OlympusBX/HARV
《温病条辨》中的《安宫牛黄丸》化裁而来,以冰片、镜(日本),恒温加热仪(
ARD/L
栀子、麝香、郁金四味中药作为主要成分,具有抗氧美国),--***苯丙氨酸(上海恒创生物科技
PBSHPLC
化、抗炎等重要作用。已有研究表明,醒脑静注射有限公司),缓冲液,甲醇、水、正己烷(
级,CNWTechnologies),吡啶、TBSTFA+
液进入人体后能对脑组织发挥保护作用[]。课题组
%TMCS、%的O-***羟***盐酸盐、(CNW
既往研究表明,醒脑静注射液对脑缺血急性期半暗
Technologies),***仿(AR级,Titan),种脂肪酸甲
带区脑组织具有一定的保护作用,减轻了脑缺血后
酯(Larodan、Nc-chek、DR),气浴恒温振荡器(江苏
对微血管、胶质细胞和神经元损伤[]。但在脑缺血
环宇科学仪器厂),冷冻浓缩离心干燥器(江苏太仓
再灌注损伤后对代谢物的影响等方面尚未有报道,
市华美生化仪器厂),真空干燥箱(上海慧泰有限公
本研究利用大鼠脑缺血再灌注模型以及代谢组学
司),色谱柱DB-MS(型号:m×.mm×.
相关技术,探究醒脑静注射液干预后脑组织内源性
μm),气相色谱-质谱联用仪(Agilent/美国)。
代谢物的变化和相关通路,为临床应用提供新的理
.模型制备
论依据。
线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型,术前禁食
材料与方法
不禁水h。给予各组大鼠%的戊巴比妥(.
.动物
mL/g)剂量腹腔麻醉,术中置于℃的恒温毯
SPFSD±
级雄性大鼠共计只,体重(上密切关注的各项体征。对大鼠颈部进行备皮消
g
),所有实验动物由北京维通利华实验动物技术毒,剪开皮肤筋膜使胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌钝性
SCXK
有限公司提供(许可证编号:[(京)-分离,暴露右侧颈总动脉并将颈外动脉与颈内动脉
])。本实验中所有的实验动物被饲养于北京分离至分叉后,颈外动脉近分叉处结扎并使用电凝
中医药大学东直门医院屏障环境动物室(许可证编器熔断,在颈外动脉近心端距分叉约mm处剪开
号:[SCYK(京)-])。所有动物食水自由切口,插入线栓至颈内动脉进线长度距离分叉处约
并保持垫料清洁。本实验已通过北京中医药大学为~mm,出现阻力时停止,使用浸湿生理盐水
东直门医院医学与实验动物伦理委员会审查,且在的纱布覆盖伤口,缺血min后拔出栓线灌注后进
整个实验过程严格遵守实验动物管理规定,动物实行结扎,结扎后依次缝合颈部皮肤后碘伏消毒,假
验伦理编号:-。手术组大鼠只进行血管分离术,动物清醒后使用改
万方数据
.
良神经功能缺损评分法评定大鼠神经功能,~组织加入含有内标的离心管,-℃冰箱放置min
分可视为造模成功[]。造模成功后将大鼠放置于清后研磨,加入μL***仿涡旋混匀min,经冰浴超
洁的鼠笼,使其自由饮食。声后提取、静置、离心吸取上清μL。质控样品
.分组与给药在离心浓缩干燥机中干燥,加入μL盐酸吡啶甲
造模成功后的大鼠每组只,随机分成模型组、氧基***溶液涡旋振荡min,℃培养箱中与肟反
醒脑静组。给药时间为在造模成功后h。将临床应min,加入μL的BSTFA(含%TMCS)和
常用量按照体表面积折算后,,加入μL的个内标涡旋、反应
g的用量腹腔注射药物醒脑静注射液。模型组h,室温放置min,进行代谢组学分析。
和假手术组注射同剂量的生理盐水。各组每日均..色谱条件与质谱条件载气为高纯氦气,
给药次。DB-MS毛细管柱,柱温箱初始温度为℃(保持
.),升温分别为℃/min至℃、℃/min至
给药d后,每组选只大鼠麻醉并仰卧固定于℃、℃/min至℃、℃/min至℃(保
解剖板,剪开胸腔使心脏显露并游离,灌注针从左持min)。电子轰击离子源(EI)离子源温度为
心室经心尖插入主动脉弓,夹闭腹主动脉剪开右心℃,四极杆的温度为℃,电子能量为eV。
耳,灌注无菌生理盐水mL,
变白,灌注%多聚甲醛mL,断头取脑h后采用主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘
进行脱水透明与石蜡包埋。石蜡切片机连续冠状判别分析法(OPLS-DA)对数据进行分析。并根据
切片(厚度μm),烘烤h后HE染色。烤片minOPLS-DA模型所得的变量权重值(VIP)>和T检
后将切片置于在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各缸中各脱蜡验所得的概率值P(P<.)为标准,筛选出组间
min。移入水化下行的酒精缸与自来水中各min。差异性代谢物。
苏木精染液染色min,冲掉多余染液后使用.%结果
盐酸酒精分化s,水洗返蓝min。
.%伊红染液色min,冲掉多余染液。依次经假手术组(图A)的大鼠脑组织细胞排列致密
%、%、%、%、%Ⅰ、%Ⅱ酒精缸整齐,其基本形态结构正常未发现明显病理改变。
梯度脱水各min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各透明min,模型组(图B)大鼠脑组织梗死区出现坏死,细胞排
封片。使用光学显微镜观察梗死区及周边脑组织列较为疏松不规则,细胞出现水肿变性,细胞核出
形态变化并拍摄图像。现皱缩。与模型组相比,醒脑静组(图C)大鼠的脑
.GC-MS代谢组学组织结构紊乱减轻,细胞核结构较清晰,核固缩和
..样本处理每组只大鼠麻醉后断头取脑分核溶解程度降低,脑缺血再灌注造成的脑损伤有所
离梗死周边皮层组织,使用.%生理盐水清洗后减轻。见图。
放入冻存管液氮速冻后进行样本处理。取mg脑
A:假手术组;B:模型组;C:醒脑静组
图脑缺血再灌注大鼠术后d脑组织结构病理变化(HE染色,×)
FigPathologicalchangesofbraintissuestructureinratswithcerebralischemiareperfusiondaysaftersurgery(HE
staining,×)
万方数据
‑‐⁃MS代谢组学的醒脑静注射液干预脑缺血再灌注大鼠模型的作用机制研究
.大鼠脑组织质控样本总离子流叠加图时间的保留基本一致。在此基础上本研究继续采
通过对比QC样品总离子流图的重叠情况,可用多种分析法对醒脑静组、模型组、假手术组之间
得出各峰之间很好地分离,各峰的反应程度和对于的差异代谢物进行分析。见图。
图大鼠脑组织质控样本总离子流叠加图
FigSuperpositionoftotalioncurrentinratbraintissuequalitycontrolsamples
.PCA得分图与其系统稳定性分析DA分析方法对大鼠脑组织样品进行分析。OPLS-
PCA得分图中的每一个符号点代表一个脑组DA得分图中模型组与假手术组、醒脑静组与模型
织样品,各组样品在空间分布位置的不同,代表了组的分离显著,聚类程度较好,说明内源性代谢产
不同组别样本的代谢状况。模型组与假手术组的物在模型组与假手术组、醒脑静组与模型组之间存
OPLSDA
位置分布分离趋势十分明显,说明采用线栓法大鼠在显著差异。-置换图中RX与RY值越
脑缺血再灌注模型大鼠脑组织代谢物产生了较为接近表明模型拟合数据效果越好,且当Q在Y轴
明显的差异。醒脑静组与模型组分离明显组间差上的截距小于时表明分析模型可靠。OPLS-DA
异较大,说明给药醒脑静注射液干预后内源性代谢置换图中,模型组与假手术组对比RX=.、RY
物发生了明显的改变。见图、。=.,醒脑静组与模型组对比RX=.、RY
=.,说明该模型拟合效果良好。模型组与假手
术组对比Q在Y轴上的截距=-.,醒脑静组与
模型组对比Q在Y轴上的截距=-.,表明分析
模型稳定可靠。见图、。
.差异代谢物分析结果
醒脑静组与模型组经过分析筛选后得出了
个差异代谢物,在这些差异代谢物中,上调的
PCA
图模型组与假手术组的得分图差异代谢物有个,下调的差异代谢物有个。
FigPCAscoreofmodegroupandshamoperation上调的差异代谢物有L-谷氨酰***、硼酸、亚精***、
group氨基甲酸、,-二羟基吡啶等代谢物。下调的差
异代谢物有-氨基异丁酸、天冬氨酸盐、联苯、十
二烷醇、胞嘧啶、没食子酸、黏液酸等代谢物,差
异代谢物的结果见表。
.代谢通路富集分析
通过KEGG代谢物数据库对个差异代谢
物进行代谢途径富集分析,得到的路径分析结
果。纵坐标代表代谢途径,横坐标代表富集因
图醒脑静组与模型组的PCA得分图子。富集因子的大小显示出代谢差异物在该条
FigPCAscoreofXingnaojinggroupandmodelgroup途径上的富集程度。结果表明氨基丙酸代谢、丙
氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、嘧啶代谢、组氨酸
.正交偏最小二乘方法判别分析(OPLS-DA)代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等是
进一步寻找各组间差异变量,用监督OPLS-其重要的相关代谢途径。见图。
万方数据
卜卜卜二巾朗甇甇旦
.
图模型组与假手术组的OPLS-DA的得分图与OPLS-DA置换检验图
FigOPLS-DAscoreofmodelgroupandshamoperationgroupandOPLS-DApermutationtestchart
图醒脑静组与模型组的OPLS-DA的得分图与OPLS-DA置换检验图
FigOPLS-DAscoreandOPLS-DAreplacementtestofXingnaojingandmodelgroup
表模型组与醒脑静组差异代谢物结果表(n=)
TabResultsofdifferentmetabolitesbetweenmodelgroupandXingnaojinggroup(n=)
差异代谢物名称VIPFP醒脑静vs模型
L-glutaminedehydratedL-谷氨酰***...↑
-aminoisobutyricacid-氨基异丁酸...↓
Boricacid硼酸...↑
Aspartate天冬氨酸盐...↓
Spermidine亚精***...↑
Biphenyl联苯...↓
Dodecanol十二烷醇...↓
Carbamicacid氨基甲酸...↑
Cytosin胞嘧啶...↓
,-dihydroxypyridine,-二羟基吡啶...↑
Gallicacid没食子酸...↓
Mucicacid黏液酸...↓
讨论
代谢组学是对被干扰或刺激的生物系统的观
察,是对生物体代谢物随时间变化或代谢物变化的
研究。脑缺血再灌注损伤是指脑组织在出现一段
时间缺血后,脑组织和细胞的血流量又重新得到恢
复,但组织与细胞的损伤程度反而加重的状况。脑
缺血再灌注损伤绝不是一个由单环节、单因素、多
单途径参与的作用结果[]。大量研究结果显示,使
用醒脑静注射液应用于脑缺血再灌注后,具有抑制
炎症与自噬、减轻氧化应激与神经损伤以及抑制神
经细胞凋亡等重要作用[,]。本文采用了HE染色
图代谢通路气泡图
法观察脑组织病理生理变化并基于GC-MS代谢组
FigBubblediagramofmetabolicpathway
学技术对醒脑静注射液调节代谢物进一步进行探
讨。HE染色结果显示,模型组的脑组织出现一定
万方数据
●●—琣
‑‐⁃MS代谢组学的醒脑静注射液干预脑缺血再灌注大鼠模型的作用机制研究
程度的坏死、组织细胞排列不齐且出现细胞核皱下降,精氨酸含量与脑梗死和神经功能损害呈负相
缩。而醒脑静组的脑组织结构紊乱明显减轻,细胞关[,]。亚精***是哺乳动物组织中的一种氨酸代谢
核结构较清晰,核固缩程度也有所降低,提示醒脑物,并已有研究发现亚精***在调节血管张力方面发
静注射液对大鼠脑缺血再灌注具有保护和改善挥着关键作用[]。代谢组学结果显示,脑缺血再灌
功能。注病理过程中伴随着氨基酸及其衍生产物的水平
改变,如在醒脑静组与模型组的差异代谢物对比
代谢结果显示,大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组
中,亚精***代谢物的水平在醒脑静注射液干预后有
织内源性代谢物紊乱。其中模型组与假手术组对
所上调。说明醒脑静注射液可促使代谢物的水平
比后发现共有个代谢物与脑缺血再灌注有关,主
趋于正常化。
要参与氨酰生物合成、癌症的中心碳代谢、淀粉和
此外ABC转运蛋白、谷胱甘肽代谢也发挥了重
蔗糖代谢、ABC转运蛋白、谷胱甘肽代谢、半乳糖代
要的作用。ABC转运蛋白是现存物种中规模最大、
谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、精氨酸
种类最丰富的超家族蛋白之一,并在细胞稳态、细
和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和
胞信号转导、药物代谢和营养吸收等许多生物过程
色氨酸的生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、
中发挥着极为重要作用,它们通过限制或减少神经
果糖和甘露糖的代谢等。在醒脑静组与模型组的
***在大脑中的积累来发挥组织保护的生理功
对比中共发现差异代谢物个,涉及β-丙氨酸代
能[]。谷胱甘肽是人体内含量最丰富的抗氧化剂,
谢、嘧啶代谢、ABC转运蛋白、氮代谢、丙氨酸、天冬
在抗氧化防御系统和维持神经元氧化还原稳态中
氨酸和谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、组氨酸代谢、抗
起着至关重要的作用[]。在本实验研究的富集通
坏血酸和阿尔尿酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸
路中发现醒脑静组差异代谢物可通过ABC转运蛋
代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代
白、谷胱甘肽代谢等通路对脑缺血再灌注大鼠模型
谢等多个代谢通路。
起到调节作用。
氨基酸不仅是作为蛋白质的基本组成单位也
上述研究表明醒脑静注射液对脑缺血再灌注
是人体代谢尤为重要能量来源,其异常情况将直接
大鼠具有良好的治疗效果,减少神经细胞损伤,通
影响到蛋白质的合成与人体的代谢情况[]。在脑缺
过氨基酸代谢、ABC转运蛋白、谷胱甘肽代谢等途
血再灌注的病理生理过程中,氨基酸代谢贯穿始
径起到调节作用。本研究还存在一些不足,需对差
终,是其中最为显著的代谢特征[]。L-谷氨酰***作
异代谢物进行进一步的验证分析,未来还需要在体
为肌肉和肝脏中最丰富的氨基酸之一,对生长与免
内外对已发现的代谢物和途径以及相关的生物学
疫、抗氧化应激、抗感染与疲劳、维持酸碱平衡等多
过程进行研究。
个方面发挥着不可忽视的作用[]。此外,L-谷氨酰
***作为抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)的前体,具有抗氧
作者贡献度说明:
[]
化应激的重要作用。研究证明,L-谷氨酰***可减高永红负责实验设计,刘浩琦和张涵莱负责动物造模实
少缺血性损伤小鼠的脑梗死体积并具有恢复神经验,李媛媛和宋珂负责病理染色实验,安娜和王丽琴负责统
行为的效果[]。本研究结果显示醒脑静组与模型计,孙逸坤与高永红负责审校。文章由刘浩琦和张涵莱共同
组相比,L-谷氨酰***明显上升,说明醒脑静注射液执笔,拥有同样的贡献度。
可能通过L-谷氨酰***的上调作用对氨基酸代谢进
参考文献
行调节,从而促进脑缺血的改善。
彭斌,[J].
还有一些代谢差异物,也通过氨基酸代谢通路
中华神经科志,,():-.
β
对脑缺血再灌注有所改善,如-丙氨酸、谷氨酸、精MoskowitzMA,LoEH,
氨酸等。β-丙氨酸是一种非蛋白原性的β-氨基酸,stroke:Mechanismsinsearchoftreatments[J].Neuron,
它是已知的含组氨酸的二肽肌肽的限速前体[]。,():-.
研究发现,β-丙氨酸作为一种主要的能源性食物补吴京霓,刘瑞敏,许丹妮,-MS技术及网络
充剂,能够通过有效增加肌肉肌肽水平来改善运动药理学探讨醒脑静注射液入脑成分抗脑缺血损伤的作
用机制[J].中草药,,():-.
表现[]。谷氨酸作为兴奋性的氨基酸,维持着机体
孙逸坤,吴丽君,李媛媛,
的正