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·78·20222382JClinStomatol,,,
富血小板血浆通过信号通路
NF-κBp65/BMP-7
促进骨髓基质干细胞成骨分化的研究
*
李名禄1,马兵2
(武汉市黄陂区人民医院口腔科湖北武汉;武汉存济口腔医院湖北武汉)

[摘要]目的:探讨富血小板血浆促进大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的具体机制方法:选取只月龄的
。102
雄性大鼠将其脱颈处死消毒后获其骨髓心尖取血制备富血小板血浆分离纯化大鼠骨髓基质干细胞
SD,,,
根据处理条件不同分为空白对照组富血小板血浆组组富血小板血浆抑制剂
(BMSCs)。,、(PRP)、+NF-κBBay11-
联合处理组检测细胞活性骨涎蛋白与骨钙素及的表达水平结果:组
7082,ALP、mRNA、NF-κBp65BMP-7。PRP、
联合处理组骨髓基质干细胞骨涎蛋白与骨钙素蛋白水平明显高于空白对照组且
ALP、mRNA、NF-κBp65、BMP-7,
组上述指标高于联合处理组差异均有统计学意义P组和联合处理组矿化结节数量均高于空白
PRP,(<)。PRP
对照组组高于联合处理组P结论:富血小板血浆可通过信号通路促进骨髓基质
,PRP(<)。NF-κBp65/BMP-7
干细胞成骨分化加入抑制剂可部分抑制这种促成骨作用
,NF-κBBay11-7082。
[关键词]富血小板血浆骨髓基质干细胞大鼠成骨分化
;;;
[中图分类号][文献标识码]
Q813Adoi:.1003-
PlateletrichplasmapromotesosteogenicdifferentiationofbonemarrowstromalcellsthroughNF-κBp65/
BMP--lu1MABing2*.
,’,,;
.
,,
AbstractObjective
[]:Toinvestigatetheregulationofplateletrichplasmaonosteogenicdifferentiationofratbone
Methods
marrowstromalcells(BMSCs)anditsmechanism.:Ten2-month-oldmaleSpragueDawleyratswerekilledanddis-

stemcells(BMSCs)-
mentconditions,theyweredividedintoblankcontrolgroup,plateletrichplasmagroupandplateletrichplasma+NF-κBinhib-
itorBay11-(ALP)wasdetectedbyALPkit,themRNA
contentofbonesialoproteinandosteocalcinwasdetectedbyRT-PCR,andthecontentsofNF-κBp65andBMP-7weredetec-
Results
tedbyWesternBlot.:ThelevelsofALP,bonesialoproteinandosteocalcinmRNA,NF-κBp65andBMP-7inbone
marrowstromalstemcellsofplateletrichplasmagroupandcombinedtreatmentgroupweresignificantlyhigherthanthoseof
blankcontrolgroup,andtheaboveindexesofplateletrichplasmagroupwerehigherthanthoseofcombinedtreatmentgroup,
*通信作者马兵
:,E-mail:******@
王艳红刘帆刘浩男等酪蛋白磷酸肽无定形磷酸钙对正畸作用评价上海口腔医学
[12],,,.-[J].,2020,29(1):46-50.
术后釉质再矿化的效果评价上海口腔医学汪晓彤饶南荃谢静等酪蛋白磷酸肽无定型磷酸钙凝胶治
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疗釉质脱矿效果的系统评价华西口腔医学杂志
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闻静周春华王苏豫光学相干断层成像观测碳酸饮料所致年
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轻恒牙釉质脱矿的实验研究临床口腔医学杂志伍廷芸王德堂朱友家等不同非含***护牙剂对牙釉质酸蚀后再
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赵岩高平酪蛋白磷酸钙复合体对乳牙脱矿釉质再矿化作用用的体外研究牙体牙髓牙周病学杂志
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的体外实验研究实用口腔医学杂志
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冀美玲薛欣朱颐馨等***化物和促进乳牙早期釉俞晓峰卢友光陈舟等贝哥仕促进釉质再矿化的体外研究
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质龋再矿化的体外研究哈尔滨医科大学学报福建医科大学学报
[J].,2016,50(6):[J].,2020,54(5):348-351.
收稿日期:
525--09-10
孙旸高承志含***涂漆与或生物活性玻璃对根龋的
[17],.CPP-ACP
临床口腔医学杂志年月第卷第期
20222382JClinStomatol,,,·79·
P
thedifferenceswerestatisticallysignificant(<).Thenumberofmineralizednodulesinbothplateletrichplasmagroup
andcombinedtreatmentgroupwashigherthanthatinblankcontrolgroup,andthatinplateletrichplasmagroupwashigher
PConclusion
thanthatincombinedtreatmentgroup(<).:Plateletrichplasmacanpromotetheosteogenicdifferentia-
tionofbonemarrowstromalstemcellsthroughNF-κBp65/BMP-7signalingpathway,whichcanbepartiallyinhibitedbythe
additionofNF-κBinhibitorBay11-7082.
Keywords
[]Plateletrichplasma;Bonemarrowstromalstemcells;Rats;Osteogenicdifferentiation
随着医学材料学的发展口腔种植修复成为牙列检测指标
、,4
缺损和缺失的首选修复方式[1]口腔种植技术常面临碱性磷酸酶活性根据
。①(alkalinephosphatase,ALP):ALP
局部骨量不足与不能形成良好骨结合的难题生长因试剂盒合肥莱尔生物科技有限公司中国说明书操作于
(,),
,处酶标仪测各孔吸光度值值检测细胞活性
子可促进骨组织再生和重建因富血小板血浆520nm(OD),ALP。
。(plate-方法检测骨诞蛋白骨钙素表达水平
含有大量生长因子且在骨组织②qRT-PCR、mRNA。
letrichplasma,PRP),按照试剂盒说明书提取细胞总引物由赛默飞世尔
再生软骨组织修复等领域发挥重要作用目前已广泛TrizolRNA,
、,公司合成反应体系上游引物下游引物
应用临床[2-4]其能促进细胞增殖分化趋化和刺激血。RT-PCR:25μL,1μL,
,、、水反应参数
1μL,,cDNA2mL,;:94℃
管分化等[5]中含有多种高浓度生长因子的联合个循环最后个循环结束后做溶
。PRP35s,94℃12s,63℃32s,36,1
作用刺激成骨加速骨缺损处的修复[6]自体取解曲线确定反应质量为内参并设置无模板阴
,。PRP,PCR,GAPDH,
材方便制备简单无疾病传播和机体排斥反应可诱性对照引物序列见表
,,,;PCR1。
导成骨细胞形成加速骨结合在口腔种植领域应用前
表引物序列
,,1PCR
景广阔然而促进成骨的机制复杂还有待进一
。PRP,基因引物序列
步研究[7]本研究将分析富血小板血浆对大鼠骨髓基
,骨诞蛋白正向引物
质干细胞成骨分化的作用及其机制:5’-TCCACACCATTGGGACCATC-3’
。反向引物
:5’-TGGTAATGGTTGGTGTTTCCA-3’
骨钙素正向引物
材料和方法:5’-GCAGCGAGGTAGTAGTGAAGAGA-3’
反向引物
:5’-CTCCTGAAAGCCGATGTGG-3’
正向引物
骨髓基质干细胞的--
1(bonemarrowstromalcells,BMSCs)GAPDH:5’GACAACTTTGGCATCCTGGA3’
纯化及培养反向引物
:5’-ATCCAGGGATGATGTTCTGG-3’
选取只月龄的雄性大鼠脱颈处死无菌分离大鼠
102SD,法检测骨形态发生蛋白
股骨胫骨获取骨髓细胞悬液将其高速离心获得单细③WesternBlotNF-κBp65、-7(bone
、,,BMSCs的含量实验重复次
胞悬液收集到的接种于含新生牛血清的morphogeneticprotein7,BMP-7)。3。
。BMSCs10%DMEM细胞外基质矿化检测分组接种于孔板
培养液中置于培养箱中传代培养观察生长情
④:BMSCs6,PRP
,37℃、5%CO2,干预后弃细胞上清液冲洗次后酒精固定
况待贴壁细胞接近铺满瓶底时加入胰蛋白酶消化传代选
,,PBS3,75%1h,
。,。茜素红细胞外基质染色去离子
择第代对数生长期细胞测定表型并进一步制备40mmol/L(pH=)10min。
3CD44,CD45,水漂洗试样次直至不再脱色体式显微镜
成骨髓基质干细胞悬液备用
5,(SMZ1270,Nikon,
。日本照相每孔添加***化十六烷基吡啶
的制备
)。500μL10%(CPC)
2PRP溶解出与钙元素结合的茜素红染料吸取出孔内液体至
心尖取血制备富血小板血浆采用二次离心法制备先
30min,,
,PRP,孔板使用分光光度仪
将装有全血离心管r离心离心后血
96。(ThermoFisherScientific,Evolution
8mL,4℃1500/min8min,美国检测波长时各溶液值用仅含的液
液分为层将上层血浆中间白细胞血小板层移至离心管260,)562nmOD,CPC
3,、、B体孔调零
中离心管再以r离心留取上层血浆及。
,B4℃1500/min15min,统计学分析
白细胞血小板制备完成
5
、,PRP。应用统计软件进行分析实验数据以xs表
,(±)
3示同一时间点组间比较及同一组组内各时间点的比较采用单
取第代生长良好的根据处理条件不同分为,
3~5BMSCs,,因素方差分析P为差异有统计学意义
空白对照组富血小板血浆组组富血小板血浆核因子,<。
、(PRP)、+
抑制剂浓度
κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)Bay11-7082(
联合处理组空白对照组加入等量生理盐水将结果
50μmol/L),。3
组孔板同时置于的孵育箱内进行培养每天
2
9637℃、5%CO,2
换液次培养时间分别为作用不同时间点对活性的影响
1,1d、3d、7d、14d。1PRPBMSCsALP
临床口腔医学杂志年月第卷第期
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空白对照组细胞活性随着时间点变化差异无统计学光学显微镜观察发现茜素红矿化结节染色后组均能观
ALP,,3
意义P但在组和联合处理组均随着时间的变化察到矿化结节空白对照组矿化结节数量较少呈现零星散在分
(>)。PRP,,
值增大P组和联合处理组在不同时间点上均布联合处理组结节数量明显多于空白对照组组结节数
OD(<)。PRP;;PRP
高于对照组且组高于联合处理组差异具有统计学意义量最多且连接成片状和团块状矿化结节半定量结果组之
,PRP,,。,3
P表间有显著差异P组矿化含量最高空白组含量最
(<)(2)。(<),PRP,
低图
表组不同时间点活性xs(2)。
23ALP(±)
表
时间点空白对照组联合处理组组F值P值组中骨涎蛋白和骨钙素表达xs
PRP33BMSCsmRNA(±)
组别骨诞蛋白骨钙素
①①②
±±±
空白对照组
①①②
±±±<±±
联合处理组
①①②①①
±±±±±
组
①①②①②①②
±±±<±±
F值F值

P值P值

注①与对照组相比P②与联合处理组相比P注①与对照组相比P②与联合处理组相比P
:,<;,<:,<;,<
对骨涎蛋白和骨钙素的影响
2PRPBMSCsmRNA
组和联合处理组骨涎蛋白和骨钙素含量均高
PRPmRNA
于空白对照组组高于联合处理组P表
,PRP(<)(3)。
蛋白含量
3NF-κBp65、BMP-7
组和联合处理组蛋白含量均高于
PRPNF-κBp65、BMP-7
空白对照组组高于联合处理组P图表
,PRP(<)(1,4)。图组以及蛋白表达结果
对成骨分化的影响13NF-κBp65BMP-7WesternBlot
4PRPBMSCs
表组蛋白表达水平xs
43NF-κBp65、BMP-7(±)
组别NF-κBp65BMP-7
3d7d14d3d7d14d
空白对照组
±±±±±±
联合处理组①①①①①
±±±±±±
组①②①②①②①②①②①②
±±±±±±
F值

P值

注①与对照组相比P②与联合处理组相比P
:,<;,<
讨论
牙列缺损和缺失目前的主要治疗方式为口腔种植
修复种植成功的关键在于与牙槽骨形成良好的骨结
,
合利用多种生长因子来促进新骨形成是目前临床研
。
究的热点临床来源广泛制作方法较简单对患
。PRP,,
者创伤较小已在口腔种植领域得到较多的应用骨
,。
髓间充质干细胞是人体骨髓中成骨分化的原始细胞
,
对骨改建起至关重要作用牙槽骨增量手术中需开放
注茜素红染色情况茜素红染色半定量分析**P
:A~C:(×16);D:,<;,
***P骨髓腔激活破骨细胞同时释放更多生长因子引导
,<,,,
图成骨分化茜素红染色分析骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化实现骨改建促进
2BMSCs,
临床口腔医学杂志年月第卷第期
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成骨因此和骨髓间充质干细胞之间的作用机质干细胞向成骨分化为其中之一
。,PRP,NF-κBp65/BMP-7,
制研究成为热点但含有多种生长因子其对骨抑制该通路后可部分抑制骨髓基质干细胞成骨分化
。PRP,。
髓基质干细胞的成骨分化调节机制复杂多样本课题茜素红染色半定量结果表明使用可以增加矿化
,PRP
仅对信号通路进行初步探索结节数量而使用抑制剂减少钙化
NF-κBp65/BMP-7。,NF-κBBay11-7082
但由于其血小板浓度高各类促生长因子含结节数量提示在调节骨髓间充质干
PRP、,NF-κBp65PRP
量丰富将其填充于缺损的牙槽骨处可加速愈合这细胞分化成骨的过程中发挥积极的作用
,。。
种作用的发挥有赖于中高浓度各类生长因子包
PRP,
括血小板源性生长因子转化生长因子血管内皮生长参考文献
、、[]
因子以及胰岛素样生长因子等调节细胞生长分
,、
张文杰口腔种植修复牙列缺损的美学价值及临床效果研究分析
化[8]在骨形成和生长过程中具有重要作[1].
。NF-κB中国口腔种植学杂志
用[9,10]有研究通过对新生大鼠跖骨的免疫组织学[J].,2020,25(4):158-160.
,SD舒妍富血小板血浆联合骨粉和海奥生物膜在糖尿病
和检测后发现亚基在干骺端[2].Bio-Oss
患者口腔种植骨再生中的应用效果实用临床医药杂志
WesternBlot,NF-κBp65[J].,
高表达而和亚基相对表达较低[11]
,p50p52。Janssen-
2020,24(1):3638.
等[12]报道例杂合子突变基因的患者该基因
1IκB-α,[3]XuJ,GouL,ZhangP,-richplasmaandregenerativeden-
突变造成功能失活从而导致患者身材矮小
NF-κB,。tistry[J].AustDentJ,2020,65(2):131-142.
张丽高静肖长杰富血小板血浆在修复牙周组织缺损中的
近年研究表明抑制经典通路中功能增强[4],,.
,NF-κBp65应用研究临床口腔医学杂志
间充质细胞的体外成骨细胞分化[9]转染特异[J].,2011,27(1):34-36.
C2C12。顾珊贺海鹏李红文等富血小板血浆在口腔再生医学中的应
性抑制基因的转基因年轻小鼠骨小梁量明显高[5],,,.
用赣南医学院学报
NF-κB-
于对照组成年转基因小鼠能防止由于卵巢切除引起[J].,2019,39(8):842845,860.
,[6]DingZY,TanY,PengQ,-
的骨量丧失抑制信号能阻断对
。NF-κBTNFTGF-βtratesintissueregeneration(Review)[J].ExpTherMed,2021,21
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Smad,MC3T3裴延平林松杉富血小板纤维蛋白的临床应用临床口腔医
胞前体细胞系和裸鼠骨髓间充质细胞的分化和矿化[7],.[J].
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孙金环郭良微周晋等富血小板血浆复合脱钙牙本质基质修
NF-κBSaos2。NF-κB[8],,,.
信号在破骨细胞成骨细胞和成软骨细胞分化方面具复颌骨缺损的实验研究临床口腔医学杂志
、[J].,2015,31(12):
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李亚芳乔义强与信号通路在调控成骨方
活性是成骨样细胞分化成熟的重要标志之[9],.NF-κBWnt/β-catenin
ALP面的研究进展河南医学研究
一其活性的高低可以反映不同组织向成骨方向转化[J].,2019,28(4):767-769.
,王辰王宇琛徐璐璐信号通路介导人脱落乳牙牙髓干
的趋势[14]骨涎蛋白骨钙素为骨基质成分是细胞[10],,.NF-κB
。、,细胞促进破骨细胞形成的体外实验研究临床口腔医学杂志
在不同时期分泌的两种能够反映骨细胞分化及成骨干[J].,
-
2019,35(2):6771.
细胞矿化能力的检测指标本实验结果显示组牛增志王乐禹胡晓芳等介导的前列腺素分泌
。,PRP[11],,,.NF-κBp65E2
活性增强骨涎蛋白骨钙素表达增加富及结合抑制因子蛋白表达在促进大鼠桡骨骨折早期愈合
ALP,、mRNA,DNA2
的作用中国修复重建外科杂志
血小板血浆可促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨分化-
[J].,2011,25(5):569574.
。
进一步研究显示该组和蛋白表达显[12]JanssenR,vanWengenA,HoeveMA,
NF-κBp65BMP-7
著增强表明其通过信号通路促进mutationintworelatedindividualsleadstocompletelydifferentclinical
,NF-κBp65/BMP-7-
成骨分化使用特异性抑制剂syndromes[J].JExpMed,2004,200(5):55968.
BMSCs。NF-κBBay11-
[13]XuW,LuY,YueJ,-
进行干预结果显示富血小板血浆抑制剂
7082,+NF-κBationandboneformationthroughIKK-NF-κBsignaling[J].JPeriod-
联合处理组活性骨涎蛋白和骨钙素ontol,2020,91(5):683-692.
Bay11-7082ALP、杜小颖丁威薇陈悦等通过信号通路促进
水平高于对照组但显著低于组联合处[14],,,.IGF-1PI3K/AKT
mRNA,PRP。牙髓细胞增殖及碱性磷酸酶活性的研究口腔医学研究
理组均低于同一时间对照组及[J].,
NF-κBp65、BMP-72017,33(5):538-541.
组提示富血小板血浆可通过多通道促进骨髓基收稿日期:
PRP,2021-06-23