真菌快速检测试剂盒及其检测方法.docx

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专利名称:真菌快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域:
本发明属于临床微生物鉴定技术领域,具体涉及一种快速鉴定临床样本真菌的试剂盒及检测方法。
背景技术:
随着肿瘤的放射治疗、化学治疗、广谱抗生素以及免疫制剂的广泛应用,系统性、机会性真菌感染日益增加,特别是在血液系统恶性疾病、肿瘤和骨髓移植及器官移植中。例如18%50%的病人在骨髓移植后发生侵染性真菌感染;器官移植受者和恶性肿瘤患者中真菌感染的患病率高达20%40%。据我国医院感染检测网分析,%%,随着真菌感染日益增多,抗真菌药的使用导致真菌耐药性也逐渐增加。侵染性真菌病多发生在有严重基础疾病的患者,其预后差、病死率高,念珠菌病病死率为30%40%,曲霉菌病病死率高达50%100%。在大器官移植患者中侵染性真菌感染已成为患者死亡的重要因素之一。据近年有关文献报道,真菌感染上升速度如此之快,主要原因可能有以下几点1广谱及超广谱抗生素不加控制的使用,破坏了人体正常微生态平衡而引起真菌感染;2免疫低下人群比例增加,如ICU病房患者,肿瘤、血液病、艾滋病及老年患者均为高危病房,高危病种,高危人群;
3介入性治疗和外科手术的改进提高了病人的生存率,同时也为侵入性真菌感染创造了条件。而各种抗真菌药物的滥用,更加剧了真菌感染的复发和增加了治疗难度。因此,对临床上建立快速真菌分离培养、鉴定显得尤为重要,可大大改善临床治疗效^ο真菌病的诊断目前主要依靠常规直接镜检及培养和形态学鉴定发现和确认病原菌,其操作繁琐、费时、并且需要高度的专业知识。尤其对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难。直接镜检操作简便、快速、实用,阳性结果可以确定真菌感染,但检测阳性率很低,阴性结果不能排除感染,需与培养法结合使用,如在无菌体液的直接镜检中发现真菌成分常可确立深部真菌病的诊断,但在有菌部位则只有发现大量真菌菌丝才具有诊断意义。培养检查法可进一步提高阳性率,但其操作复杂,费时费力,培养时间一般为4周,个别生长缓慢的菌则需要更久,而且培养法的阳性检出率也不高。免疫学技术诊断临床真菌感染因抗体检测交叉反应严重、特异性抗原检测同样存在的假阴性和假阳性问题限制了其应用。基因芯片技术虽然能够同时进行多种真菌的鉴定,但涵盖的菌种面窄,对非常见菌、突变菌或者新菌种无能为力,成本过高也是制约其发展的重要因素,杂交方式固有的局限性影响了其特异性。今年来,质谱技术以其快速准确的优点被用于微生物鉴定,由于质谱鉴定必须是培养后分纯的单克隆菌落,而且
设备昂贵,操作难度高等限制了其应用。其实在现实研究工作中,基于对rDNA-ITS的长度多态性和序列多态性的序列分析,由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来反应生物亲缘关系与分类情况,因而成为真菌分类及鉴定研究的热点,目前已广泛应用于真菌的属种间及部分种内组群水平的系统学研究。真菌核糖体DNA(rDNA)上的保守序列广泛,有着不同的进化水平的区域序列,可用于不同等级的真菌分类鉴定。核糖体DNA上的内转录间隔区ITS是存在于18SrDNA、,该区域受外界环境因素的影响小,与编码区相比具有进化速度快的特点,在种内的不同菌株之间高度保守,而在真菌种间存在极大的变化,表现出极大的序列多态性,可以为真菌学的研究提供丰富的遗传信息。因此以真菌rDNA序列分析为基础,基于内转录间隔区序列标记具有的保守特性,满足临床病原真菌的鉴定,在较短时间内就可以对病原真菌进行分类鉴定,鉴定未知或难培养真菌,便于对临床病症进行早期诊断并实施有效治疗。焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳,DN***段也无须荧光标记,操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应,在每一轮测序反应中,只加入一种dNTP,若该dNTP与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基
团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号,并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP,继续DNA链的合成。焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析,通量高、操作方便,便于构建标准化操作流程,因此广受研究者青睐,并在很多方面已应用于临床微生物的分型鉴定。Gharizaden等(2004)第一次用焦磷酸测序技术通过rDNA_ITS中的一对通用引物测定酵母菌18SRNA异变区的40个碱基序列来对酵母菌进行分型。Jason等(2005)以ITS2区通用引物,通过实时定量PCR用焦磷酸测序技术对231例真菌性***炎进行测序分析,在测序的第一个循环就可以鉴定出绝大多数致病菌。Leaw等(2006)利用内转录间隔区通过焦磷酸测序分析鉴定医学重要的酵母菌属致病真菌,通过两组不同特异性引物成功扩增ITSl和ITS2区,经测序成功鉴定标准菌株和医学致病菌到种的水平,该研究还发现ITS1区比ITS2区在种内鉴定水平上更具有特异性,因此,该方法还能将将具有高度保守的***滑念珠菌I-III群区分开来。Bobby等(2007)通过焦磷酸测序技术应用rDNAITS2区段基因检测假丝酵母致病菌,结果与生化和形态学检测比较,显示了100%—致性。Andrew等(2008)同样利用焦磷酸测序技术快速鉴定出非常见治病真菌,并且能鉴定出引起混合型感染的真
菌。Kang等(2009)根据ITS核苷酸序列区域特异性碱基的不同,将新生隐球菌3个变种进一步分为8个基因型。本研究通过设计软件对常见临床真菌测序引物随后40bp的序列进行了排列组合,产生了多重不同真菌感染的焦磷酸测序虚拟模式数据库,临床样品经DNA抽提、通用引物扩增,然后用通用引物作为测序引物,测序结果与焦磷酸测序虚拟模式数据库比对判断型别。该方法能一次测序区分常见临床真菌,可用于真菌感染的临床诊断及耐药监测。采用的空白对照可以在型别判断中有效扣除可能发生的污染,解决了高的灵敏度必然带来难以控制的污染难题。快速可靠鉴定痰、尿液、分泌物等临床样本中真菌种属的重要意义在于1)合理应用抗生素,避免无效用药;2)改善预后;3)减缓获得耐药;4)减少医疗费用5)高度的特异性和敏感性,6)大大缩短了检出时间。不合适抗生素应用常常导致治疗失败,而使住院期延长,并发症,耐药以及检验费用增加等后果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速可靠的真菌快速检测试剂盒。本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下一种真菌快速检测试剂盒,它包括(1)扩增真菌18S,:1
禾口SEQIDNO2所示引物对;(2)测序引物其核苷酸序列如SEQIDNO3所示;(3)亲和素标记的磁珠;其中,SEQIDNO:1在其5,端标记生物素;在一次检测中共同使用。上述真菌快速检测试剂盒,具体包括如下试剂(I)DNA提取试剂BufferI,BufferII,BufferIII;BufferTE;其中,BufferI为9g/LNaCl水溶液;其中,BufferII为10g/LSDS,2%(v/v)TritonΧ-100,100mmol/LNaCl,IOmmolTris-HCl(),lmmol/LEDTA,溶剂为水;其中,BufferIII为饱和NaCl水溶液(约6mol/L);其中,BufferTE为10mmol/LTris-HCl(),lmmol/LEDTA,溶剂为水;(2)反应液PCRBuffer,通用引物SEQIDNO:12,2mMMgCl2,,2U/μLTaqDNA聚合酶;其中,PCRBuffer具体为0·1%(ν/ν)ΝΡ-40,0·02%(ν/ν)明胶,%g/mLBSA,%(v/v)Tween-20,(3)单链纯化试剂75%(v/v)乙醇溶液,0·2MNaOH,-Acetate溶液,结合缓冲液,退火缓冲液;其中,结合缓冲液具体为10mMTris_HCl,2MNaCl,ImMEDTA,%(v/v)Tween-20;-Acetate,2mM醋酸镁。(4)测序试剂DNA聚合酶,ATP硫酸化酶,荧光素酶,三磷酸腺苷双磷酸酶,底物APS,荧光素和dNTP(dNTP即dATPS,dTTP,dCTP,dGTP)。一种真菌快速检测试剂盒,它包括上述的所有核苷酸序列的碱基互补序列,也就
是包括(1)扩增真菌18S,;由上海英俊生物科技有限公司合成。(2)测序引物其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示;由上海英俊生物科技有限公司合成。(3)亲和素标记的磁珠;其中,SEQIDNO4在其5’端标记生物素;由上海英俊生物科技有限公司合成。在一次检测中共同使用。上述真菌快速检测试剂盒,具体包括如下试剂(I)DNA提取试剂Buffer!,BufferII,BufferIII;BufferTE;
其中,BufferI为9g/LNaCl水溶液;其中,BufferII为10g/LSDS,2%(v/v)TritonX-100,100mmol/LNaCl,IOmmolTris-HCl(),lmmol/LEDTA,溶剂为水;其中,BufferIII为饱和NaCl水溶液(约6mol/L);其中,BufferTE为10mmol/LTris-HCl(),lmmol/LEDTA,溶剂为水;(2)反应液PCRBuffer,通用引物SEQIDNO:34,2mMMgCl2,,2U/μLTaqDNA聚合酶;其中,%(ν/ν)NP-40,%(ν/ν)明胶,0·06%(w/v)g/mLBSA,%(v/v)Tween-20,·9Tricine0(3)单链纯化试剂75%(ν/ν)乙醇溶液,0·2MNaOH,-Acetate溶液,结合缓冲液,退火缓冲液;其中,结合缓冲液具体为
10mMTris_HCl,2MNaCl,ImMEDTA,%(v/v)Tween-20;-Acetate,2mM醋酸镁。(4)测序试剂DNA聚合酶,ATP硫酸化酶,荧光素酶,三磷酸腺苷双磷酸酶,底物APS,荧光素和dNTP(dNTP即dATPS,dTTP,dCTP,dGTP)。本发明所检测的真菌为狭义的真菌菌,包括念珠菌属、隐球菌属、球孢子菌属、组织胞浆菌属、芽生菌属、曲霉菌属、毛霉菌属、根霉菌属。上述真菌快速检测试剂盒的检测方法包括如下步骤(1)提取临床样本中真菌DNA;(2)以步骤⑴所得DNA为模板,利用通用引物进行真菌18S,;(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化;(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序;(5)测序结果与数据库比对判断真菌种属。步骤(2)中,所述的PCR扩增体系为10XPCRbuffer5μL,SEQIDNO:10·3μL,SEQIDNO:,TemplateDNA2μL,,2mMMgCl2,TaqDNA聚合酶2U,加无菌水至50μL;PCR扩增条件为94°C5min;40个循环,94°C30s,58°C30s,72°C30s;72°C5min。或者将SEQIDNO:4替换上述SEQIDNO:1,同时将SEQIDNO:54替换上述SEQIDNO:2,其它PCR扩增体系和条件相同。有益效果本发明的试剂盒利用焦磷酸测序技术测定的ITSl反向区段的序列和数据库比对判断真菌种属。应用此试剂盒能一次测序鉴定临床样本真菌种属。可用于临床
诊断。不仅为临床诊疗赢得了宝贵的抢救时间,而且具有成本低廉,操作方便,特异性强的优点。本发明方法可以使临床样本真菌种属鉴定时间大大缩短(本发明方法检测时间约45小时),另外,通过序列比对鉴定真菌是菌种鉴定的终极方法,特别是对一些难鉴定菌,序列比对鉴定更具优势。
图1为1例阴性标本检测结果图,测序结果为阴性。图2为1例真菌感染标本检测结果图,测序结果为GAAAGTTTTG
7ACTATTTAGTAATAATCTGGTG,与数据库比对判定为白假丝酵母菌。图3为1例真菌感染标本检测结果图,测序结果为GAAAGTTTTGAAGTTGTTTTCATATCATAAAAAGAAATTCGTTTGG,与数据库比对判定为光滑假丝酵母。图4为1例真菌感染标本检测结果图,测序结果GAAAGTTTTGACTATTGTAATAATAAATCAAGTTTG,与数据库比对判定为热带假丝酵母。图5为1例真菌感染标本检测结果图,测序结果为GAAAGTTTTATTATTGTTATAATAAGATTACATTC,与数据库比对判定为新型隐球菌。图6为1例真菌感染标本检测结果图,测序结果为GAAAGTTTTGATTTAGTTTGTTAGAATAAAATTTATTTTG,与数据库比对判定为葡萄牙假丝酵母。图7为1例真菌感染标本检测结果图,测序结果为GAAGTTTTGACTATTAGTTAATCAAGTTGAC,与数据库比对判定为***滑假丝酵母。
具体实施例方式根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实