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专利名称:益生双歧杆菌菌株的制作方法
益生双歧杆菌菌株
引言
本发明涉及双歧杆菌菌株及其作为益生菌具体是作为免疫调节生物治疗剂的用途。
保护人类胃肠道免受肠道细菌定植的防御机制相当复杂并涉及到免疫
学和非免疫学的领域(l)。先天防御机制包括胃的低pH,胆汁盐,蠕动,黏蛋白层以及抗微生物化合物,例如溶菌酶(2)。免疫学机制包括分布于整个小肠和结肠的特发性淋巴集结,基础性M细胞,又称为派伊尔淋巴集结(3)。腔内抗原在这些位点上的提呈导致了对适当T和B细胞亚型的刺激,从而建立了细胞因子网络并将抗体分泌至胃肠道中去(4)。此外,可通过上皮细胞将抗原提呈至上皮内淋巴细胞以及基础粘膜固有层免疫细胞(5)。因此,宿主相当程度地依赖于胃肠道的免疫防御。然而,由于胃肠道粘膜是宿主与外界环境相互作用的最大表面,发生于其上的具体控制机制必需能够适当地对平均寿命期间由胃肠道处理的上百吨食物进行免疫应答的调节。不仅如此,消化道定植有超过500种的细菌,在结肠中的数量为10U-10力g。因此,这些控制机制必需能够从对宿主引起明显伤害的侵袭性病原体中区
别出非致病性的附着细菌。事实上,通过与新摄入的潜在致病性微生物竞争,肠道菌群对宿主的防御大有裨益。
存在于人类胃肠道中的细菌能够引起炎症。对固有微生物菌群的异常免疫应答可涉及到某些疾病状态,例如炎性肠病。与正常菌群相关的抗原通常会导致免疫耐受,而不能达到这样的耐受是粘膜发炎的主要机制(6)。在患有炎性肠病(IBD)的患者中,其耐受被破坏的证据包括针对于所述肠道菌群的抗体水平升高。
本发明涉及双歧杆菌菌株,其可通过调制细胞因子水平或通过抗拮以及排除来自胃肠道的促炎症微生物从而表现出具有免疫调节的作用。
发明内容
本发明提供了双歧杆菌菌株AH1205(NCIMB41387)或其突变株或变异株。所述突变株是遗传修饰的突变株。所述变异株是天然存在的双歧杆菌变异株。
所述菌株是益生菌。其是生物学纯培养物的形式。
本发明还提供了双歧杆菌NCIMB41387的分离株。在本发明的一个实施方案中,双歧杆菌菌株是活性细胞的形式。或者
双歧杆菌菌株是以非活性细胞形式存在的
在本发明的一个实施方案中,所述双歧杆菌菌株是从婴儿粪便中分离
的,所述双歧杆菌菌株在口服之后在人中具有明显的免疫调节性。
本发明还提供了包含本发明所述双歧杆菌菌株的制剂。在本发明的一个实施方案中,所述制剂包括其他的益生性物质。在本发明的一个实施方案中,所述制剂包括有益生元物质。优选地,所述制剂包括可摄取的载体。所述可摄取的载体可以是药用
的可接受载体,例如胶囊、片剂或粉末。优选地,所述可摄取的载体可以
是食物制品,例如酸化乳、酸奶、冷冻酸奶、奶粉、浓縮奶、软干酪、调
料或饮料。
在本发明的一个实施方案中,本发明所述制机还包含有蛋白和/或肽,特别是富含谷氨酰***/谷氨酸的蛋白和/或肽、脂类、碳水化合物、维生素、矿物质和/或痕量元素。
在本发明的一个实施方案中,双歧杆菌菌株在每克递送系统中以大于10^fU的量存在于所述制剂中。优选地,所述制剂包括一种或多种佐剂、细菌成分、药物实体或生物学化合物。
在本发明的一个实施方案中,所述制剂可用于免疫和接种方案。
本发明还提供了本发明的双歧杆菌菌株或制剂,其可用作食物,用作药物,用于预防和/或治疗不良炎性活性,用于预防和/或治疗不良呼吸道炎性活性(例如哮喘),用于预防和/或治疗不良胃肠道炎性活性(例如炎性肠病如克罗恩氏病或溃疡性结
肠炎、肠易激综合征、慢性肠炎、或感染后结肠炎),用于预防和/或治疗胃肠道癌症,用于预防和/或治疗系统性疾病例如类风湿性关节炎,用于预防和域治疗由不良炎性活性所引起的自身免疫失调,用于预防和/或治疗由不良炎性活性所引起的癌症,用于预防癌症,用于预防和/或治疗由不良炎性活性所引起的腹泻疾病(例如与艰难梭菌(Clostridiumdifficile)相关的腹泻、与轮状病毒相关的腹泻或感染后腹泻),用于预防和/或治疗由感染性因子例如大肠杆菌所引起的腹泻疾病。
本发明还提供了用于制备一种抗炎生物治疗剂以预防和/或治疗不良炎
性活性,或用于制备多种抗炎生物治疗剂以预防和/或治疗不良炎性活性的
本发明所述双歧杆菌菌株或制剂。
在本发明的一个实施方案中,本发明所述菌株可通过抗拮以及从胃肠
道中排除促炎症反应的微生物来发挥作用。
本发明还提供了用于制备抗炎生物治疗剂从而降低促炎症细胞因子水
平的本发明所述双歧杆菌菌株或制剂。
本发明还提供了用于制备抗炎生物治疗剂从而调节IL-10水平的本发
明所述双歧杆菌菌株。
由于双歧杆菌菌株具有拮抗致病物种生长的能力,本发明还提供了将双歧杆菌菌株作为抗感染益生菌的用途。
发明人还发现特定的双歧杆菌菌株能够在体外引起免疫调节的效果。
本发明因此在预防或治疗失调免疫应答,例如不良炎症反应(如哮喘)时具有极大的潜在治疗价值。
双歧杆菌是共生性微生物。其是从人体胃肠道内的微生物菌群中分离得到的。由于其导致的炎性活性同样会破坏宿主细胞及组织的功能,所以胃肠道内的免疫系统并不会对这类菌群的成员产生明显的反应。因此,存在一些机制,凭借着所述的机制免疫系统能够识别与致病性生物体所不同的胃肠道菌群中的共生性非致病成员。这确保了对宿主组织的损伤是被限制的并依然保留了防御性的屏障。
长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)菌株AH1205在2006年5月11日被保藏于NCIMB,其记录的保藏号码为NCIMB41387。
所述长双歧杆菌可以是遗传修饰的突变株,或者可以是天然存在的变异株。
优选地,所述长双歧杆菌是活性细胞的形式。
或者,所述长双歧杆菌可以是非活性细胞的形式。
应该理解,本发明的特定双歧杆菌菌株可以口服摄入的形式以常规的
制剂例如胶囊、微胶囊、片剂、颗粒、粉末、锭剂、丸剂、栓剂、悬液和糖浆对动物(包括人类)进行给药。适合的制剂可通过使用常规的有机和无机添加剂采用常规方法来制备。药物组合物中的活性成分量可根据所需要的治疗效果来进行操作。
所述制剂还可包含细菌成分、药物实体或生物学化合物。此外,还可使用任意适合的公知方法,并可包含药物可接受的载体或佐剂来制备含有本发明所述菌株的疫苗。
在本说明书中,术语突变株,变异株以及遗传修饰的突变株包括与亲本菌株相比,其基因型和/或表现型性质都发生改变的双歧杆菌菌株。天然存在的长双歧杆菌变异株包括对所分离到所选定靶向性质的自发改变。对亲本菌株性质的故意改变是通过常规(体外)遗传操作技术,例如基因破坏,
接合转移等来实现的。遗传修饰包括例如通过载体(包括质粒DNA或噬菌体)向细菌菌株的基因组进行插入而将外源和/或内源DNA序列导入双歧杆菌菌株的基因组。
天然或诱导的突变包括至少单个碱基的改变,例如缺失、插入、转换或其他DNA修饰,其可导致由所述DNA序列所编码氨基酸序列的改变。
术语突变株,变异株以及遗传修饰的突变株还包括这样的双歧杆菌菌株,其经历了遗传改变,所述遗传改变以对于自然界中的所有微生物一致
的速率在基因组中累积,和/或所述遗传改变通过自发突变和/或基因的获取和/或基因的丢失而发生,其不是通过对基因组进行故意(体外)操作实现的,而是通过当暴露于环境压力例如抗生素时能够提供选择性优势从而支持细菌生存的对变异株和/或突变株的自然选择来实现的。可以通过向基因组中故意(体外)插入特定基因来产生突变株,其并没有在根本上改变所述生物体生物体的生物化学功能,但其产物可用来对细菌的例如抗生素抗性进行鉴定或筛选。
本领域所属技术人员应该理解双歧杆菌的突变株或变异株可通过与亲本菌株的DNA序列同源性分析进行鉴定。与亲本菌株具有接近序列一致性的双歧杆菌菌株被认为是突变株或变异株。与亲本菌株具有96%或更高序列一致性(同源性),例如97%或更高,或98%或更高,或99%或更高的双歧杆菌菌株被认为是突变株或变异株。可使用在线同源性算法"BLAST"程序,公开于http:/,来确定序列的同源性。
亲本菌株的突变株还包括得自与所述亲本菌株的16s-23s基因间间隔子多核苷酸序列具有至少85%序列同源性,例如至少90%序列同源性,或至少95%序列同源性的双歧杆菌菌株。这些突变株还包含在细菌基因组中其他DNA序列的DNA突变。
附图简述
图1为长双歧杆菌AH1205的BOXPCR(生物分析仪)条形码图。使用Agilent2100软件确定碱基对大小。
图2图示了在8天饲喂阶段中长双歧杆菌AH1205的粪便回收,并证实了AH1205能够在鼠胃肠道中转移的能力。
图3为条线图,显示长双歧杆菌AH1205对于人PBMC的IL-10细胞因子产生的影响。结果表示为平均值+ASE(r^6)。
图4A和B图示了益生菌株AH1205(A)和安慰剂(B)对于经卵清蛋白(OVA)攻击之后的致敏动物的支气管肺泡灌洗液中总、细胞数的影响(1^10/组,相对于单独的OVA*=p256。肠道转移
为确定长双歧杆菌能否在相当于胃中发现的低pH值条件下存活,从新鲜的过夜培养物中收集细菌细胞,用磷酸缓冲液(pH6,5)洗涤2次并重悬于(采用1MHC1)。将细胞保温于37°C并使用平板计数法在5,30,60和120分钟测定存活情况。,但在30分钟之后则不能回收到具有活性的细胞。
从胃排出之后,推定的益生菌将暴露于小肠中的胆汁盐。为了确定长双歧杆菌暴露于胆汁条件下的存活能力,%(w/v)、%、1%、2%、5%、%或10。/。猪胆汁的TPY琼脂平板上。%胆汁的平板上都观察到了长双歧杆菌的生长。
在鼠模型中,对长双歧杆菌AH1205在胃肠道中的转移能力进行了评估。对每日摄入lxl09AH1205的小鼠以及粪便颗粒进行了饲喂微生物存在的检测。对AH1205的检测是通过分离自发形成的双歧杆菌利福平抗性变异株来辅助的-将利福平加入用于评价转移的TPY平板,确保仅有所饲喂的利福平抗性双歧杆菌得以培养。每日收集粪便样本并确认长双歧杆菌转移通过胃肠道(图2)。
抗微生物活性
将用于本研究中的指示性致病微生物在以下生长条件下在下述培养基中进行扩增鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(37。C,需氧)。/。酵母汁(TSAYE,Oxoid)的胰蛋白胨大豆肉汤/琼脂培养基中,空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)(37。C,厌氧)和大肠杆菌0157:H7(37。C,厌氧)在血琼脂培养基中,艰难梭菌(Clostridiumdifficile)(37。C,厌氧)在加强梭菌培养基(RCM,Oxiod)中。所有菌株都接种于新鲜的生长培养基并于实验之前进行过夜生长。
使用延迟的方法(9)来检测抗微生物活性。简言之,将长双歧杆菌AH1205保温36-48小时。将10倍连续稀释液涂平板(100^il)于TPY琼脂培养基上。在过夜保温之后,将指示细菌覆盖于具有完全分开菌落的平板上。指示菌苔是通过向已接种
TPY平板的表面倾倒接种有2。/。(v/v)过夜指示培养物的融化覆盖物来制备的。所述平板在适合指示细菌(indicatorbacterium)生长的条件下再次保温过夜。抑菌圈半径大于lmm的指示培养物可被考虑为对所述检测细菌敏感。长双歧杆菌AH1205能够抑制所有检测的致病性生物体的生长,所测定的透明圈对鼠沙门氏菌,空肠弯曲杆菌,大肠杆菌0157:、>80、。
实施例2:PBMC对长双歧杆菌反应产生细胞因子
通过密度梯度离心从健康供体分离外周血单核细胞(PBMC)。用益生菌菌株在37。C对PBMC剌激72小时。在此时,收集培养物上清液,离心,分装并保存于-70。C直到使用流式微珠阵列(BDBioSciences)来对IL-10的水平进行分析。AH1205诱导人PBMC显著分泌IL-10,提示这一益生菌株能够在体内诱导抗炎症应答(图3)。
实施例3:在鼠哮喘模型中长双歧杆菌AH1205能够减轻呼吸道疾病
本研究调査了是否益生菌长双歧杆菌AH1205能否抑制过敏性气道炎症的卵清蛋白(OVA)致敏小鼠模型中的过敏反应。简言之,通过在0天和6天腹腔注射OVA致敏成年雄性BALBZc小鼠。在12天和14天用OVA进行鼻内攻击。在最后一次攻击(第15天)的24小时之后,测定小鼠的气道反