疫苗组合物的制作方法.docx

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专利名称:疫苗组合物的制作方法
技术领域:
本发明涉及病毒载体,包括编码HIV多肽的寡核苷酸,更具体地,其中所述病毒载体是腺病毒。具体而言,此类腺病毒是非人灵长类动物腺病毒,诸如猿猴腺病毒(simianadenovirus),更具体地,是黑猩猩腺病毒。具体而言,本发明涉及包括HIV多核苷酸序列的腺病毒载体,该序列编码多种不同的HIV抗原,例如,两种或三种或者更多种HIV抗原。本发明进一步涉及制备所述病毒载体的方法,涉及通过本方法所制备的病毒载体,并涉及所述载体在医药,尤其是在预防性或者治疗性疫苗接种方面的用途。HIV-1是导致获得性免疫缺陷综合征(theacquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS)的主要原因,该病症被认为是世界上的主要健康问题之一。尽管在世界范围内已进行了广泛的研究,但生产疫苗的努力至今尚未获得成功。HIV-1是反转录病毒科的一种RNA病毒。HIV基因组编码至少九种蛋白,其被划分为三个种类:主要的结构蛋白Gag、Pol和Env,调控蛋白Tat和Rev,以及辅助蛋白(accessoryproteins)Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因组显示了所有反转录病毒的5'LTR-gag-pol-env-LTR3'组织方式。腺病毒是一种双链DNA病毒,基因组大小大约36kb,由于其具有在多种靶组织中获得高效基因转移的能力以及巨大的转基因容量而被广泛地用于基因转移。按常规,腺病毒的
El基因缺失,并用转基因盒替换,该转基因盒由所选的启动子、感兴趣基因的cDNA序列和polyA信号组成,从而产生复制缺陷型重组病毒。腺病毒具有典型的二十面体衣壳形态,其包括三种主要的蛋白,六邻体(hexon)
(II)、五邻体基底(pentonbase)(III)和具圆柄的纤维(IV),以及大量的其它次要蛋白V1、VII1、IX、IIIa和IVa2(,GenVirol,81:2573-2604)。该病毒的基因组是线性双链DNA,5'末端与末端蛋白共价结合,所述5'末端具有反向末端重复序列(invertedterminalrepeats,ITRs)。病毒DNA与高碱性蛋白VII以及被命名为mu小肽紧密结合。另一种蛋白,V,与此DNA-蛋白复合体包装在一起,并通过蛋白VI提供了一种连接至衣壳的结构链。此病毒同样包含病毒编码的蛋白酶,其对于加工一些结构蛋白以产生出成熟的传染性病毒而言是必要的。100种以上不同血清型的腺病毒已被分离出来,其感染不同种类的哺乳动物,其中51种是人类起源的。此类人类起源的腺病毒实例为Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、AdlUAd24、Ad34、Ad35。人类的血清型根据一些生物学、化学、免疫学和结构标准已被划分为六个亚类(A-F)[第一页,W004018627]。尽管基于Ad5的载体已在大量的基因治疗试验中被广泛地使用,但是由于自然感染而在总体人群中预先存在的免疫性,使得
Ad5以及其它C组腺病毒载体的使用可能受到限制。Ad5以及其它C组成员容易成为血清阳性率最高的血清型之一。对现有载体的免疫性可能由于在治疗期间暴露于该载体而得以发展。此类对血清阳性载体的预先存在的或者发展的免疫性可能会限制基因治疗或者接种疫苗努力的功效。因此,在寻找能够规避宿主免疫反应的基因递送系统时,可选的腺病毒血清型构成了非常重要的靶标。可选血清型的一种此类范围是非人灵长类动物的腺病毒,尤其是黑猩猩腺病毒。参见美国专利6,083,716,其描述了两种黑猩猩腺病毒的基因组。已表明黑猩猩("Pan"或"C")腺病毒载体如同人腺病毒载体一样有效地诱导对转基因产物的强烈的免疫反应(:1416)。HIVTat和Nef蛋白是早期蛋白,即它们是在感染的早期,在缺乏结构蛋白的情况下表达。Nef基因编码一种早期的辅助性HIV蛋白,其已被表明具有若干种活性。例如,已知Nef蛋白能够引起CD4,HIV受体,从细胞表面的清除,尽管此功能的生物学重要性还有争议。此外,Nef与T细胞的信号通路相互作用并诱导了一种活化状态,此状态反过来可以促进更有效的基因表达。一些HIV分离物在此区域内具有突变,其致使它们无法编码功能蛋白并导致其在体内复制和致病过程中严重受损。Gag基因是由全长RNA翻译而来,以产生一种前体多聚蛋白,其随后被剪切成
3_5种衣壳蛋白;基质蛋白、衣壳蛋白和核酸结合蛋白以及蛋白酶。(FundamentalVirology,FieldsBN,)。Gag基因产生出55-千道尔顿(kD)的Gag前体蛋白,也被称为p55,其由未经剪接的病毒mRNA表达。在翻译过程中,p55的N末端被豆蘧酰化,这引发了其与细胞膜胞质面的结合。膜结合的Gag多聚蛋白募集了病毒基因组RNA的两个拷贝,以及其它病毒蛋白和细胞蛋白,这引发了病毒颗粒从感染细胞的表面出芽。出芽后,在病毒成熟期间P55被病毒编码的蛋白酶(Pol基因的产物)切割为四种更小的蛋白,被命名为MA(基质matrix[pl7])、CA(衣壳capsid[p24])、NC(核壳体nucleocapsid[p9])和ρ6.(4)。
除三种主要的Gag蛋白(pl7,p24andp9)之外,所有Gag前体都含有若干个其它区域,其被切割下来并作为各种大小的肽保留在病毒粒子中。这些蛋白具有不同的作用,例如P2蛋白被提出在调节蛋白酶活性方面具有作用,并且有助于对蛋白水解加工进行正确的时间选择。MA多肽来源于p55的N-端,豆蘧酰化末端。大多数MA分子保持连接于病毒粒子脂双层的内表面,使该病毒颗粒稳定。一套(subset)MA在病毒粒子更深层的内部被募集,在其中它成为复合物的一部分,该复合物护送病毒DNA至细胞核。这些MA分子促进了病毒基因组的核转运,因为MA上的亲细胞核信号被细胞的核输入机器所识别。此现象使
HIV能够感染不发生分裂的细胞,对反转录病毒而言是一种不寻常的特性。p24(CA)蛋白构成病毒颗粒的圆锥形核心。亲环蛋白A(CyclophilinA)已被证实与p55的p24区域相互作用,导致其整合入HIV颗粒中。Gag与亲环蛋白A之间的相互作用是必不可少的,因为通过环孢菌素A破坏这种相互作用抑制了病毒的复制。Gag的NC区负责特异性地识别所谓HIV包装信号。该包装信号由定位于病毒RNA5'末端附近的四个茎环结构组成,并且足以介导将异源RNA整合进HIV-1病毒粒子中。NC通过由两个锌指基元介导的相互作用而结合于包装信号。NC同样有助于反转录过程。p6多肽区介导p55Gag和辅助蛋白Vpr之间的相互作用,导致Vpr被整合入装配中的病毒粒子。p6区同样含有所谓的晚期结构域(Iatedomain),其是出芽的病毒粒子从感染细胞中有效释放所必需的。Pol基因编码三种具有病毒早期感染所需活性的蛋白,反转录酶RT、蛋白酶以及使病毒DNA整合入细胞DNA所需的整合酶蛋白。Pol的初级产物被病毒粒子的蛋白酶切割以产生氨基末端的RT肽,其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA指导的DNA聚合酶,核糖核酸酶H),以及羧基末端的整合酶蛋白。HIVRT是全长RT(p66)与剪切产物(P51)的异源二聚体,其缺少羧基末端核糖核酸酶整合酶结构域。RT是反转录病毒基因组所编码的最高度保守的蛋白之一。RT的两种主要活性是DNAPol和核糖核酸酶H。RT
的DNAPol活性可互换地(interchangeably)使用RNA和DNA作为模板,而且如同所有已知的DNA聚合酶一样,无法从头启始DNA合成,而是需要预先存在的分子作为引物(RNA)。当进行DNA合成时,所有RT蛋白所固有的核糖核酸酶H活性在复制早期去除RNA基因组的过程中发挥着基本的作用。它从所有RNA-DNA杂合体分子中选择性地降解RNA。在结构上,聚合酶和核糖核酸酶H占据了Pol中分开且不相重叠的结构域,占Pol三分之二
的氨基酸。p66的催化亚基被折叠成5个不同的亚结构域。其氨基末端23是具有具RT活性的部分。其羧基末端是核糖核酸酶H的结构域。在感染宿主细胞后,反转录病毒的R`NA基因组被反转录酶拷贝成线性的dsDNA,所述反转录酶存在于传染性颗粒中。整合酶(在SkalkaAM'99AdvinVirusRes52271-273中综述)识别病毒DNA的末端,修整它们并陪伴病毒DNA至宿主染色体位点以催化整合。宿主DNA中的许多位点可以是整合的靶标。尽管整合酶足以催化体外整合,但它并不是唯一与病毒DNA体内结合的蛋白,从被感染的细胞中分离出来的大的蛋白-病毒DNA复合物被称为整合前复合物(preintegrationcomplex)。这有助于通过子代病毒基因组来获取宿主细胞的基因。整合酶由三个不同的结构域组成,N末端结构域、催化核心和C末端结构域。催化核心结构域包含了所有聚核苷酰基转移化学所需的条件。病毒载体,特别是含有多个外源基因的腺病毒载体并非总是容易制备。可能存在载体稳定性方面的问题,以及获得插入基因有效表达方面的困难。特别是,包含一种以上或者两
种以上HIV多核苷酸的腺病毒尚未被成功制备出来,所述多核苷酸可以被用于疫苗中。非人灵长类动物腺病毒可以从黑猩猩的肠系膜淋巴结中分离。黑猩猩腺病毒与人腺病毒亚型C十分相似,使得El缺失型病毒能够在HEK293细胞中复制。但黑猩猩腺病毒与更常见的人类血清型(Ad2和Ad5)在系统发生上不同。Pan6与Pan's5、7和9相关度更低,且在血清学上不同。存在某些大小方面的限制,其与将异源DNA插入腺病毒相关。人类腺病毒具有包装多达105%或者野生型基因组长度的能力。(Bettetall993,JVirol67(10),5911-21)。对人类腺病毒更低的包装限制已被表明为野生型基因组长度的75%(Parksetal1995,JVirol71(4),3293-8)。对于寻找对抗HIV的有效疫苗仍存在需求。
本发明提供了缺失一个或多个区域的腺病毒载体,该载体包括编码至少三种HIV抗原或者其免疫原性衍生物或免疫原性片段的一条或多条多核苷酸,其中所述载体能够在哺乳动物宿主中表达所述抗原或者片段或衍生物,并且其中所述缺失的大小以及所述一条或多条HIV多核苷酸的大小是这样的,其使得所述载体基因组的全长是野生型病毒基因组长度的85至105%。在本发明的一种实施方式中,由所述一条或多条多核苷酸编码的
HIV抗原可以是Gag、Nef和Pol。在进一步的实施方式中,Pol可以只包括RT部分。在本发明的另一种实施方式中,编码所述HIV抗原的一条或多条多核苷酸可以被安排为按Gag、RT、Nef的顺序进行转录,即Gag部分位于所产生的融合蛋白的N-末端。整个载体基因组的大小可以是例如野生型病毒基因组大小的90至100%,或者野生型病毒基因组大小的95至100%。在一种实施方式中,所述载体的全部大小可以是野生型病毒基因组大小的大约96%。用于包含在根据本发明的腺病毒载体中的特定HIV抗原是Pol、Nef和Gag或者它们的免疫原性衍生物或免疫原性片段。此类腺病毒载体可以与药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂或者佐剂一起配制以生产免疫原性组合物,包括适于治疗和/或预防HIV感染和AIDS的药物或疫苗组合物。本发明中所使用的腺病毒不同于人类群体中流行的天然存在的(prevalentnaturallyoccurring)血清型,诸如Ad2和Ad5,的腺病毒。这就避免了诱发针对所述载体的强大的免疫反应,其通过中和抗体以及影响毒性而阻断了载体的摄入,从而限制了以后施用相同血清型的功效。因此,该腺病毒载体可以是腺病毒,其并非是流行的天然存在的人类病毒血清型。从动物中分离的腺病毒含有免疫学上不同的衣壳、六邻体、五邻体和纤维组分,但它们在系统发生学上密切相关。特别地,所述病毒可以是非人类的腺病毒,诸如猿猴病毒,并且尤其是黑猩猩腺病毒,诸如
Pan5、6、7或者9。此类品系的实例在W003/000283中被描述,并可从美国典型培养物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection),10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209以及其他来源获得。理想的黑猩猩腺病毒株系是Pan5[ATCCVR-591]、Pan6[ATCCVR-592]和Pan7[ATCCVR-593]。其它合适的腺病毒包括,但不限于,黑猩猩腺病毒CI和C68(Pan9),,083,716中被加以描述;以及猿猴腺病毒包括,但不限于SVl[VR-195];SV25[SV-201];SV35;SV15;SV-34;SV-36;SV-37和狒狒腺病毒[VR-275]等。Pan5(也被称为C5)、Pan6(也被称为C6)、Pan7(也被称为07)、5￥1、5￥25和SV39的序列已被加以描述[W003/046124,2003年6月5日公布]。还参见国际专利公布号W004/16614,其描述了杂种腺病毒载体和由猿猴腺病毒SA18构建的载体。黑猩猩腺病毒由于缺少对目标种群中的腺病毒预先存在的免疫性,尤其是缺少交叉中和抗体而被认为是优于人类腺病毒血清型。与某些候选的人类腺病毒载体在目标种群中35%的交叉反应相比,黑猩猩腺病毒与预先存在的中和抗体反应的交叉反应在目标种群中仅为2%。所述黑猩猩腺病毒不同于更常见的人类亚型Ad2和Ad5,但与人类亚组E的Ad4更密切的相关,Ad4并非流行的亚型。Pan6与Pan5、7和9相关度更低。本发明的腺病毒可以是复制缺陷型。这意味着其与野生型病毒相比,在非互补细胞中具有减弱的复制能力。这可以通过使病毒突变,例如通过使涉及复制的基因缺失,例如使
Ela、Elb、E3或E4基因缺失而产生。根据本发明所述的腺病毒载体可以是包括功能性El缺失的复制缺陷型腺病毒。因此,根据本发明所述的腺病毒载体可以由于缺乏表达腺病毒Ela和Elb的能力,即在Ela和Elb中被功能性缺失而是复制缺陷型的。重组的腺病毒也可以在其它基因中包含功能性缺失[参见WO03/000283],例如在E3或E4基因中的缺失。腺病毒延迟早期基因(delayedearlygene)E3可以从构成重组病毒一部分的猿猴腺病毒序列中被去除。E3的功能不是生产重组腺病毒颗粒所必需的。因此,替换此基因产物的功能以包装在本发明中有用的重组猿猴腺病毒并不是必需的。在一项特殊的实施方式中,该重组(猿猴)腺病毒含有功能性缺失的El和E3基因。此类载体的构建过程在Royetal.,HumanGeneTherapy15:519-530,2004中被加以描述。重组腺病毒同样可以被构建为含有功能性缺失的E4基因,尽管保留E40RF6的功能可能是理想的。根据本发明的腺病毒载体也可以含有延迟早期基因E2a的缺失。缺失同样可以在猿猴腺病毒基因组的晚期基因LI至L5的任何一个中进行。同样地,中期基因(intermediategenes)IX和Iva中的缺失可能是有用的。其它缺失可以在其它结构性或非结构性腺病毒基因中进行。以上缺失可以被单个使用,即用于本发明的腺病毒序列可以只含