生物膜形成和卡泊芬净对念珠菌属血分离株生物膜结构的效应.doc

生物膜形成和卡泊芬净对念珠菌属血分离株生物膜结构的效应
念珠菌属是机会性病原菌,可导致病危患者发生浅表和全身疾病(8, 22, 44) ,与高死亡率(35%) 以及治疗费用高有关(8, 19)。本菌属是美国医院第四常见的血流感染原因,超过了革兰阴性杆菌引起的发病率(6, 17)。
最近的研究表明,本病原菌导致的大多数疾病与生物膜生长方式有关(7, 16, 28, 48)。生物膜是自发形成、生长在非生物活性或生物活性表面的微生物菌落,附着于自身产生、由胞外网状聚合物质组成的基质中(14, 15, 55),附着于植入的医疗器械时,常对抗菌治疗有难治性。
由于念珠菌属是机会性病原菌,因此可附着于网状聚合表面并产生生物膜结构,保护病原体逃避宿主防御和抗真菌药物(11, 16, 45, 48)。念珠菌生物膜对包括***霉素B (AMB)、***康唑、伊曲康唑和***康唑在内的各种抗真菌药的耐药性比其浮游相要高(20, 38, 50)。然而,生物膜相关性微生物对抗真菌药耐药的分子基础目前尚未完全明确。
在体外和体内观察到的念珠菌生物膜复合结构提示形态分化产生菌丝对生物膜的形成和成熟有重要作用(7, 32, 33)。Baillie 和 Douglas 证明了固定在菌丝或酵母相上的突变细胞虽然可变为生物膜,但是菌丝结构是为生物膜提供完整性和多层结构的必要因素(4)。据报告,***滑念珠菌、光滑念珠菌以及热带念珠菌生物膜不如白色念珠菌产生的生物膜大;然而,必须进行进一步结构分析研究以描述这些微生物形成的生物膜
(30, 31)。
念珠菌生物膜显示出来的耐药特性的机制目前未明。可能的机制包括生长率下降;生物膜上的细胞营养受限;耐药基因,尤其是编码外排泵的基因的表达;细胞密度增大;细胞衰老;或生物膜上有“持留”细胞(1, 3, 5, 29, 34, 36, 38, 43, 46, 48, 50, 51)。
棘白菌素是一类新型半合成***脂肽,具有明显的抗真菌活性。当前已上市的棘白菌素有卡泊芬净(CAS)、米卡芬净和阿尼芬净。棘白菌素在体外和体内治疗念珠菌血症和侵袭性念珠菌病显示出显著疗效(25, 27, 42)。CAS是首个获得上市许可的抗真菌药,可抑制β-1,3-葡聚糖,β-1,3-葡聚糖是念珠菌细胞壁的主要结构成分;葡聚糖合成被证明是生物膜的特别有效的靶点(29, 31, 38, 48, 50)。高浓度棘白菌素的抗真菌活性反而减弱这一矛盾现象常见于白色念珠菌分离株,且似乎在各种棘白菌素中对CAS有特异性。在高浓度棘白菌素中存活的细胞对某些药物效应敏感,表现出在CAS存在的条件下生长减慢的证据(53, 54)。最近有研究描述了在念珠菌属生物膜中的这种效应(24, 37, 47);然而,我们还不知道有阐明CAS对念珠菌生物膜结构的效应的研究。本研究旨在(i) 鉴定念珠菌属血分离株的体外生物膜生长,以及(ii) 通过扫描电镜(SEM) 获取关于CAS对与矛盾性生长(PG)有关的生物膜形态变化的效应的视觉证据。
材料和方法
生物体。本研究评价了3个临床念珠菌属分离株,包括一个白色念珠菌分离株(CA4),一个热带念珠菌分离株(CT8)以及一个***滑念珠菌分离株(CP1)。所有菌株都是从入住韦拉克鲁斯医院(贝洛奥里藏特市,巴西)重症监护病房的念珠菌血症患者中获取的。通过血清芽管试验、玉米粉吐温
80琼脂的微形态以及用ID32C系统(bioMerieux, Marcy l’Etoile, 法国)的代谢性质等传统生理和形态学方法对这些临床分离株进行鉴定。
培养基和生长条件。生物体原种保存于- 70°C。首先将每一份冰冻的原种培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂(Difco, Becton Dickinson, Sparks, MD),于 35°C 孵育24小时。然后采集菌落,将之加入一根含L-谷氨酰***、不含碳酸氢盐的RPMI 1640 肉汤培养基(Sigma Chemicals)的试管中,用3-(N-吗啉)丙磺酸(165 M; Sigma Chemicals)。 × 106 CFU/ml(600 )的标准悬液,制备后立即使用。
基底材料。从Biosurface Technologies(Bozeman, MT)购买直径为13 mm的,厚度为4 mm扁平硅圆盘。用稀释的实验室肥皂
(Versaclean; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)清洗这些圆盘,在反渗透纯净水中至少漂洗5次,在70%的酒精中漂洗一次,风干,使用前进行高压灭菌处理。
用人血清对薄膜进行预处理。本实验所用血液是从科研资源部门(疾病预防控制中心)获取的。采集的血液的供体是