考马斯亮蓝测蛋白.doc

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线
一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
蛋白质含量测定方法
凯氏定氮法
双缩脲法
Folin-酚试剂法
紫外吸收法
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
(一)、试剂:
考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。%(W/V)考马斯亮蓝G—250,%(W/V)乙醇,%(W/V)H3PO4。
标准蛋白质溶液:
纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,。
(二)、器材:
1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
100ug/ml标准蛋白(ml)







NaCl (ml)
1






考马斯亮蓝试剂(ml)
5
5
5
5
5
5
5
摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
1、
2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6
,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量的测定:
样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
—,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:
玻璃仪器要洗涤干净。
取量要准确。
玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
对照:用被测物质以外的物质作空白对照。
药品的配制(磷酸缓冲液的配制)
一、药品的配制步骤
(一)、实验准备:
准备所需的药品和玻璃仪器。
洗涤。(怎样洗涤算干净?)
(二)、计算:
1、百分比浓度计算:
1)、G/V比
例如配1% NaCl,称1g NaCl溶于100ml 水。
2)、V/V比:
例如配75%乙醇100ml,75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml无水乙醇,加25ml蒸馏水。
乙醇:***:***=2:1:2配500ml,各取200 ml,100 ml,200 ml混合。
3)G/V比:用的较少,如计算灰分中某种元素如Fe的含量。
2、摩尔浓度计算:注:药品的分子量一般在标签中注明。
1)、