实验三：药敏.ppt

实验三：药敏.ppt实验三药敏
实验内容
一、纸片扩散法(K-B法)
二、稀释法(MIC)
实验目的
一、掌握纸片扩散法的原理、操作方法、结果的判断及其临床意义。
二、掌握纸片扩散法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。
三、掌握肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判断及临床意义。
四、了解稀释法的质量控制(采用标准菌株控制可变因素)。
纸片扩散法(K-B法)
器材与试剂
菌种: 25923和金黄色葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物,(×108CFU/ml);或挑新鲜培养的单个菌落,在无菌生理盐水中研磨,。
培养基:水解酪蛋白培养基(MH琼脂)。
其他:无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。
原理:含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解,不断向纸片周围区域扩散,形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制,形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。
方法:(4人一组,2人做金葡菌标准种,2人做临床种,每种菌选4个不同的药物纸片)
1、制备MH琼脂平板:将加热融化的琼脂冷却至60℃左右时倾注于直径为9cm的无菌平板中,使琼脂厚度为4mm,待琼脂凝固后使用,如有冷凝水产生,可放置37 ℃温箱中15-30分钟后使用。
2、无菌棉签蘸取菌液,在试管内壁旋转挤去多余菌液后在平板表面均匀涂布接种3次,每次旋转平板60°,最后沿平板內缘涂布1周。
3、平板在室温下干燥5分钟,用无菌镊子将抗菌药物纸片贴于琼脂表面,各纸片中心相距大于24mm,距平板內缘大于15mm, 37 ℃温箱中孵育16-18小时,量取抑菌圈直径。
结果观察中的注意事项:
1、准确量取抑菌圈直径,若抑菌圈为椭圆形,量其最长径和最短径,取其平均值。
2、若出现双层抑菌圈,一般药物测量内圈,而磺***类药物则量其外圈。
3、若抑菌圈内有散在菌落出现,排除污染菌的存在和其他影响因素,若无污染菌等,需重做。
结果观察:
1、结果解释:用毫米尺量取抑菌圈直径,参照书上的标准判读结果。按敏感(S)、中介(I)、耐药(R)报告。
例如:抗菌药物丁***卡那霉素(AMK),每张纸片含药量30微克,抑菌圈≤14mm为耐药,15-16mm为中介,≥17mm为敏感。
2、质量控制:标准菌株的抑菌圈应落在书上的预期范围内,如果超出该范围,应为失控,而不发报告,应及时查找原因,予以纠正。
例如:抗菌药物丁***卡那霉素(AMK),每张纸片含药量30微克,标准株的抑菌圈应在20-26mm之间。
思考题:
影响因素?
1、培养基的质量:双层抑菌圈的出现?
2、纸片质量
3、接种细菌的菌量
4、孵育的温度和时间
5、操作因素
稀释法
微量稀释法
常量稀释法(试管稀释法)