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分子生物学实验94471实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
【实验目的】
熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】
~,用冰冷的***化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞,细胞膨胀成球形,可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态(感受态),petent cells)。此时,若在感受态细胞中加入质粒,则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面,经过42℃短暂的热激处理后,DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞,在不含抗生素的培养基中短暂培养,使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达,在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌(含质粒)与未转化细菌分开,转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落,而未转化的细菌则不能。
【器材与试剂】
,恒温摇床,超净工作台,低温台式离心机,分光光度计,水浴锅,高压灭菌锅,微孔滤器(),酒精灯
***化钠(AR),无水***化钙(AR),蛋白胨,酵母提取物, mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,琼脂粉,LB液体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g, 800 mL蒸馏水溶解后,,蒸馏水定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min;
LB固体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g, 800 mL蒸馏水溶解后, mol/L ,蒸馏水定容至1 000 mL,然后加入琼脂粉15 g,121℃高压灭菌20min,分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基,当温度降至60℃左右时,加入1 mL氨苄青霉素溶液(100mg/mL),混匀,分别倒入无菌培养皿;CaCl2溶液:准确称取无水*** g,用双蒸水溶解,并定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min,4℃保存;氨苄青霉素钠溶液: g,用蒸馏水溶解并定容至5 mL,用微孔滤器过滤除菌后,分装于Eppendorf管中,-20℃保存。
DH5α, pUC18质粒
【实验步骤】
mL LB液体培养基中,37℃振荡(约250r/min)培养过夜。
2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中,37℃继续振荡培养至OD
~(约2 h)。
mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中,冰浴放置10~30 min,4℃,1 500×g离心5 min,弃上清。
mL冰冷***化钙溶液轻轻悬浮,冰浴放置15 min,4℃,1 500×g离心5 min,弃上清。
mL***化钙溶液轻轻悬浮,放置在冰浴中,制成大肠杆菌感受态细胞。
6. 取5 µL pUC18质粒(不超过10 ng),加入制好的感受态细胞中,轻轻混匀,冰浴30 min。
7. 42 ℃热激90 s后,迅速置于冰浴5 min。
8. 加入800 µL培养基,37 ℃振荡(100 r/min)温育1 h,使pUC18上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。
9. 取200 µL涂布于含氨苄青霉素钠(100 µg/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37℃培养箱中培养1 h,再倒置培养过夜至菌落清晰,统计菌落数量。
【注意事项】
应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞,。
整个实验最好在低温环境下进行,以获得较高的转化效率。
每次悬浮沉淀细胞要轻缓,避免剧烈振荡。
【实验作业】
根据质粒的用量,计算本实验制备感受态的转化率(cfu/µg DNA)。
参考文献
卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京:高等教育出版社,1993. 287~289
刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京:清华大学出版社,2002. 22~25
Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: ic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1972,69:2110
4. :高等教育出版社,~55
实验二质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析
【实验目的】
熟悉碱法提取质粒以及DNA的琼脂糖电泳分析的原理和方法。
【实验原理】
在碱性条件下,染色体DNA发生变性,共价闭合的质粒DNA仍为自然状态。当溶