下载此文档

qpcr操作步骤.doc


文档分类:金融/股票/期货 | 页数:约5页 举报非法文档有奖
1/5
下载提示
  • 1.该资料是网友上传的,本站提供全文预览,预览什么样,下载就什么样。
  • 2.下载该文档所得收入归上传者、原创者。
  • 3.下载的文档,不会出现我们的网址水印。
1/5 下载此文档
文档列表 文档介绍
该【qpcr操作步骤 】是由【小吴】上传分享,文档一共【5】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【qpcr操作步骤 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。QPCR〔Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem〕即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。标准的两步法:RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-:1高质量的RNA获取,这里的高质量不是强调RNA降解,而是强调RNA的纯度,不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。基因组DNA的存在会导致定量偏高,给你错误的结果,所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理,消除DNA污染。而RNA中的杂质的污染会限制real-timePCR的反响,导致扩增失败,给你假阴性的结果。RNA的降解不是关键,一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短,150-250个bp,并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因,所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解,所有的RNA以同样的速度降解,而相比照率不会改变。2减少加样误差,在使用SYBRGreenMIX的时候,一定要先按照反响的量〔比方8个孔〕把所有的试剂一次性配成MIX然后分装,留出5微升的反响体系给模板,使用5微升是因为只有5微升以上,加样枪的误差才会比拟小,如果你仅仅是吸取一微升的话,手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差,严重影响你的定量精确度。3选择适宜的内参基因,一般用于定量PCR的内参基因有好几种,但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞,比方不同组织来源,或者是动物等等,内参基因会有差异,最好的方法是,在你的样品上先测试内参基因,找到变化最小,最稳定的一个。4适宜的引物设计,防止出现引物二聚体,非特异性扩增等。Q-PCR实验流程:①实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯翻开15-20分钟。②超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总RNA抽提1)细胞样品用1*PBS洗2次后,用1ml枪将PBS吸干净,参加1mlTrizol(invitrogen)溶液,吹打混匀,,室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨,参加1mlTrizol溶液,混匀,室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称);参加200μl***仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;3)4℃下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNasefreeEP管;(用20-200ul的枪吸取上清,吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)4)沉淀RNA:参加等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀),室温静置10min;5)4℃下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀,应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4℃下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀),去上清;6)用75%乙醇洗涤两次,1ml/次(12,000g离心5min)(参加乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干;沉淀不能过干或过湿,过干那么不易溶解,过湿那么乙醇残留。7)视沉淀量参加适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。三、去基因组使用RNase-free的DNase?(Promega),按以下体系配置反响液,37℃消化30min,65℃灭活10min。RNA?DNase??10xbuffer?H2O(RNasefree):1)参加等体积的苯酚/***仿,上下颠倒混匀,室温放置5min,后14,000rpm,离心15min,取上清。2)参加等体积的***仿,上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm,离心15min,取上清。3)参加等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次),-20℃静置15min;4)4℃下,14,000g离心15min,收集RNA沉淀,去上清;5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;6)参加适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1)纯度检测:取1μlRNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD260/,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。2)总RNA完整性检测:取RNA样品1μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min,EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA的5srRNA,18srRNA和28srRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比拟完整。五、:1)?)将上述溶液吹打均匀,置85℃保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷,以防止RNA复性;3)在该PCR管中参加以下试剂(Promega)oligo〔dT〕Randomprimer?10mMdNTP?RNaseinhibitor?5xbuffer?M-)将上述20μl反响溶液30℃保温10min;5)42℃保温50min;6)85℃保温10min;7)-20℃保存。:使用茎环逆转录法,原理如以下图:1)*)将上述溶液混匀,85℃孵育5min,以翻开RNA二级结构。随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构;3)在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液:10mMdNTP(promega)?RNaseinhibitor(promega)U6逆转录引物5xbuffer?M-MLV(promega))将3)溶液参加到1)溶液中,混匀后30℃保温10min;5)42℃孵育50min;6)85℃孵育10min灭活逆转录酶。四、:根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率,具体反响体系和反响条件如正式实验,每对引物需做模板水对照。得到结果后,首先根据熔解曲线判断引物特异性,选择标准为:单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。假设设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好,那么应比照各引物的扩增曲线,优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。确定上机内容后,先在记录本上编排好上机的样品排放顺序:(1)一个样品的加样尽可能安排在同一行(2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上,那么需把三次重复中的实验分开,但同一次重复的实验不能分开两板(3)正式实验:总体积15ul的体系配制:H2O4ulSYBRGreenPCRMasterMix10ul(TOYOBO)(使用前需振荡均匀)(10uM)(10uM)--1份体系,总的体系配好后,在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀,然后15ul每管分装至8连管中。,一般为1:20稀释,如遇到基因表达低的样品,那么适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反响体系中。加样完毕,盖好八连管盖,并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序(不可将标记写在反响管的盖子上,八连管盖防止裸手触摸中间透明的荧光采集区域,且保证每孔均盖紧,否那么影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。)。:,进入Windows界面。接着翻开PCR仪电源开关。,选择“新建〞,在“Template〞下拉菜单中选择“60〞或“65〞(普通基因检测为“60〞,MicroRNA检测为“65〞),放入八连管,关上样品架,并在软件上选择已放反响管的孔位,剔除无反响管的孔位。,输入要保存结果的文件名,命名为日期-上机时间-客户名字简写,如100830-1008-WL表示8月30日10点08分**的实验。,开始运行程序。,取出样品架上的八连管,按顺序关闭ABIPRISM7500SDS软件、PCR仪电源开关。,分类保存好结果文件。反响完成后,八连管应装到封口袋中,袋子上标记好文件名,客户的名字。(同一个客户的三次重复实验,那么只需保存其中一次重复的反响管即可,其余可丢弃)

qpcr操作步骤 来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.

相关文档 更多>>
非法内容举报中心
文档信息
  • 页数5
  • 收藏数0 收藏
  • 顶次数0
  • 上传人小吴
  • 文件大小34 KB
  • 时间2023-05-14