灰色链霉菌产链霉素汇报、.ppt

灰色链霉菌产链霉素
2017/11/9
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实验背景
实验方法
实验结果
结论
讨论
A
B
C
D
E
Contents
目
录
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一、实验背景
灰色链霉菌是一种放线菌,而高氏一号斜面培养基是一种合成培养基,可用于培养放线菌。种子扩大培养是发酵工程的一个组成部分,指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
种子扩培的一般过程是: 斜面菌种→一级种子培养(摇瓶) →二级种子培养(种子罐) →发酵。根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用,比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
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二、实验方法
1、灰色链霉菌的活化
培养基的制备
本实验原计划采用高氏培养基活化菌种,后因效果不佳,改用PDA培养基培养。因此制备PDA培养基。
斜面接种
1) 左手拿试管菌种,右手拿接种环,先将金属环烧灼灭菌,再将接种环在空白培养基处冷却,挑取菌落,在火焰旁稍等片刻
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2) 左手将试管菌种放下,拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧,迅速将接种环伸入空白斜面,在斜面培养基上轻轻划线,将菌体接种于其上。划线时由底部向上划一直线,一直划到斜面的顶部。注意勿将培养基划破,不要使菌体沾污管壁。
3)灼烧试管口,在火焰旁将棉塞塞上。接种完毕,接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
4)斜面置于28℃恒温箱中,培养2~3d观察结果。
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2、种子液的制备
将活化的菌种斜面,在无菌的条件下,注入10mL无菌水,震荡成孢子悬浮液(孢子浓度约为8×104个/mL)。待发酵培养基灭菌后冷却到28℃时,分别将孢子悬浮液接入三角瓶中,接种量为2mL,标记。
28℃、200r/min旋转式摇床培养24h,观察菌丝体形态及浓度。
3、摇瓶大量发酵
待发酵培养基(50ml)灭菌后冷却到30℃时,按接种量8%-10%进行接种,即每个发酵瓶加入5ml种子液。32℃、100r/min旋转式摇床培养24h,发酵过程中,补加灭菌尿素以增加氮源,维持pH值。
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4、枯草芽孢杆菌的活化
将配制好的蛋白胨牛肉膏培养基斜面接种枯草芽孢杆菌,方法同灰色链霉菌活化方法相同。28℃培养24h。
5、链霉素活性的鉴定
枯草芽孢杆菌悬液制备
加入1ml生理盐水于枯草芽孢杆菌斜面中,轻轻冲下菌落,,备用。
枯草芽孢杆菌悬液的稀释
用生理盐水将悬液分别稀释5倍和10倍,备用。
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涂平板
将制备好的不同浓度的枯草芽孢杆菌悬液涂布于4个制备好的LB平板,浓度分别为原液、5倍、10倍,第4个平板作为阳性对照,悬液浓度为原液。
打孔
将涂布好的平板用1ml枪头打3个孔,孔径光滑均一。
加样
将发酵液取10ml于10mlEP管内,2000r/mim离心5min,取上清加于每个孔内,加满为止,但不能溢出。阳性对照的孔内加入一定浓度的链霉素液。
37℃培养12h,观察抑菌效果。
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实验材料的准备
1、实验器材
天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、报纸、记号笔、酒精灯、接种环、250/500ml三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环、涂布棒、旋转式摇床、4℃冰箱、37℃孵箱、各型号移液枪及枪头、超净工作台等。
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2、斜面培养基的制备
高氏培养基:可溶性淀粉20g,***钾1 g,*** g, g, g, g,琼脂20 g,水1000毫升,—(配制时注意,可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中)。
PDA培养基:淀粉含量高的土豆、葡萄糖、琼脂。将土豆切成小块,煮烂用纱布滤出土豆汁。将1000ml的土豆汁中加入葡萄糖20g,琼脂15-20g。
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