高效液相色谱.doc

高效液相色谱
激素(hormone)是生物体内产生的一类调节机体代谢或生理功能的微量物质,包括天然激素和人工合成化合物,在过去几十年中已经成为环境科学和公共健康科学领域关注的一个焦点。我国于20世纪90年代起禁止将激素用于动物促生长目的,并开始相关的监测工作。然而,由于激素种类繁多、基质复杂、残留量低、分析处理步骤又较繁琐,使得动物源性食品中激素的多残留分析检测成为一个被广泛关注的热点和难点问题。
1材料与方法
试剂磷酸盐缓冲液(,,,分别取70ml磷酸二氢钾水溶液和28ml磷酸氢二钾水溶液,,置4℃中可保存一周)对照品:睾酮:Lot ,60530 (Dr. Ehrenstorfer GmbH );氘代睾酮(内标):Lot ,11808-2 (Cerilliant);孕酮: Lot ,70531( GmbH);去甲雄三烯醇酮: Lot ,70420( GmbH);氟氢甲睾酮:Lot, A004112(ACROS);己烯雌酚: Lot ,70706( GmbH)

g,置于50 ml聚丙烯离心管中,依次加入内标(),再加入20 ml 磷酸盐缓冲液,在14 000 rpm离心30 s,加入60 μL葡萄糖苷酸酶和硫酸酯酶(H2型),涡旋
50s,置37℃恒温振荡水浴中酶解16 h。取出酶解样品,冷至室温,加入20 ml甲醇,涡旋100 s,超声20 min,置冰浴中放置10 min,0~4℃离心10 min(5 000r-10 000rpm),上清液转移至150 ml烧杯中,下层沉淀再用10 ml甲醇重复上述操作1次,合并上清液,加水100 ml,混匀后待净化。
,将小柱减压抽干。将活化好的氨基柱
串接在石墨炭黑柱下方。用6 ml二氯甲烷-甲醇溶液洗脱并收集洗脱液,取下石墨炭黑柱, 再用2 ml二氯甲烷-甲醇溶液洗脱氨基柱,洗脱液氮吹至干,用1ml甲醇-水溶液(1:1)溶解残渣,涡旋1min,过滤膜,按上述液相色谱-质谱条件进行分析。
对照品溶液的制备对照品溶液的制备精密称取各激素对照品及3种内标适量用甲醇制成对照品、内标储备液,根据每种化合物的灵敏度,稀释成一定浓度的混合标准工作液和内标工作液,再用空白基质溶液配成系列浓度的基质混合标准工作液,检测当天配制。
分析方法验证
。空白基质溶液的制备:取空白样品5 g,同供试品操作,平行6份。
按色谱-质谱最佳分析条件测定睾酮等5种性激素的混合标准溶液系列,求得线性回归方程及相关系数。取适当浓度的基质标准溶液注入LC-MS/MS,测得信噪比(S/N=3:1),计算样品检出限(表1)。
检出限=对照液浓度×稀释体积/(S/N×3)×取样量
,按供试品测定操作,计算样品的加标回收率(表2)。
结果判定