实验一——鸡胚成纤维细胞的培养.ppt

第一讲鸡胚成纤维单层细胞的制备与培养
——预防兽医微生物组
实验目的
、设备

实验背景
原代细胞培养因具有细胞刚刚离体,生物性状尚未发生很大变化,具备二倍体的遗传性、来源方便等优点而广泛应用于病毒学、细胞分化、药物测试等试验。在禽类原代细胞培养中,鸡胚成纤维细胞(chickenembryo fibroblast,CEF)得到普遍应用。CEF的培养是在一定的条件下,在体外模拟体内生理环境,使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传代,并维持原有组织细胞的结构和功能特性。与其他细胞相比,CEF相对容易获得,而且增殖能力强,适应性强,具有良好的耐受性,性状比较稳定,不易发生转化,所以被广泛地应用于分子和细胞生物学研究,以及疫苗的生产。
实验材料
预加10%FCS和双抗的1640培养液;消化液(%胰蛋白酶- %EDTA溶液);D-Hanks平衡盐溶液;
灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各1个;
巴氏吸管若干支、纱布若干;眼科镊1把,剪刀1把;
碘酒,75%酒精棉球;酒精灯1台;废液缸。
实验设备
(1) 37℃-CO2培养箱
(2)倒置显微镜
(3)超净台
实验步骤
-11日龄鸡胚于蛋架上,先后用碘酒和75%酒精消毒气室部外壳。用无菌眼科镊子击破该部位的蛋壳和卵膜,撕破尿囊膜和羊膜,并轻轻夹住鸡胚颈部取出鸡胚,放入无菌平皿中。
1气室 2卵壳 3卵黄囊 4卵白 5 尿囊腔
6绒毛尿囊 7胚胎 8羊水腔 9胚胎外腔
2. 剪碎用灭菌剪刀剪去鸡胚头部、腿部、翅膀和内脏,留下躯干组织。用D-Hanks液冲洗,除去血液后移入灭菌青瓶中,用灭菌剪刀尽量剪碎(1mm3小块),再用D-Hanks冲洗2次直至组织发白为止,然后将洗液上清吸弃。

,加入大约4倍量的胰酶(5-6mL),于37℃温箱内消化15-20min,视其组织碎块变松散(聚合成一团、边缘毛样模糊)即可。轻轻吸出消化液,用D-Hank’s洗1-3次。
,用巴氏吸管反复吹吸数次,使细胞分散,制成细胞悬液。静置1分钟,使未冲散的组织块沉淀,吸出细胞悬液于20mL 营养液中。重复3次收集细胞悬液,直至鸡胚发白为止。
将纱布置于细胞瓶口,用吸管吸取细胞悬液滤过至细胞瓶中(注意不要将悬液溢出)。
℃-CO2温箱内培养。24-48h后可长成单层细胞。
实验结果
1、观察原代细胞的形态和生长状况;
2、如出现细胞培养液浑浊情况,请鉴别是否细菌污染。