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杂交瘤技术_PPT课件第10章杂交瘤技术
苏州大学医学生物技术研究所
细胞培养工程
1975年8月Kohler GE和 Milstein C第一次报道了单克隆抗体技术,后不断推广、完善,1984年获得Nobel医学生理学奖。单克隆抗体技术不仅在免疫学成为重要的常规技术,而且在其它生命学科,如细胞生物学、遗传学、微生物学、生物化学、肿瘤学等领域广泛应用;目前已不局限于科学研究领域,单克隆抗体所引起的诊断学内的革命,在临床治疗学上的意义和其它经济领域内所产生的作用,也将愈来愈显著。
杂交瘤技术的定义和起源
1. 定义:一般是指B淋巴细胞杂交瘤技术。即采用细胞融合技术将免疫脾脏细胞与同系动物的骨髓瘤细胞进行杂交,通过筛选获取分泌预定特异性抗体杂种细胞的实验技术。
2. 1975年 Kohler和 Milstein两位学者在细胞融合技术的基础上创建了这一技术,体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞(SRBC)免疫的同系小鼠脾细胞融合,建立了能分泌抗SRBC单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,并指出其可在体外持续培养,开创了抗体制备及使用的新纪元。
3. 杂交瘤技术是一项周期长、连续性强的实验技术系统。主要包括动物免疫、骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的准备、细胞融合、阳性杂交瘤的筛选、克隆化培养以及单克隆抗体的制备、纯化、鉴定等系列实验。
杂交瘤技术的基本原理
的抗体选择学说,一个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体,从一株克隆系产生的性质相同的均一抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb),具有完全相同的分子结构和生物学特性;
但这种具有分泌功能的B淋巴细胞难以在体外长期存活。
利用细胞融合技术,将上述B淋巴细胞与在体外能长期增殖的骨髓瘤细胞进行融合,经过选择培养获取的杂交细胞称为杂交瘤细胞(Hybridoma)。
该细胞既有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的功能,又具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力,应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
融合用骨髓瘤细胞
用于融合的骨髓瘤细胞大多能耐受抑制细胞代谢的毒性药物8-氮鸟嘌呤,是一种缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT)的遗传缺陷型肿瘤细胞,在HAT选择培养液中不能生长。
融合用的小鼠骨髓瘤细胞株有NS-1、SP2/0和X63等。
HAT代表次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基碟呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶(thymidine, T)三种物质。
HAT选择性培养
肿瘤细胞的DNA生物合成有两条途径,一是生物合成的主要途径,即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,进而合成DNA。在核酸合成过程中,叶酸衍生物为合成核苷酸所必需,氨基碟呤是一种叶酸拮抗物,它可阻断细胞内DNA生物合成的主要途径。
此时若培养液中含有核苷酸合成的中间产物次黄嘌呤和胸腺嘧啶,则细胞的DNA合成可通过另一条替代途径进行,即在HGPRT和 TK(thymidine )的催化下,利用外源性的次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成核苷酸。若缺乏其中一种酶,该合成途径被阻断。
抗原免疫小鼠
取小鼠脾细胞
培养SP2/0
收集SP2/0
细胞融合
HAT选择培养
筛选阳性克隆
克隆化培养
再鉴定
2次亚克隆
阳性克隆的扩增与冻存
单克隆抗体的鉴定
单克隆抗体的生产纯化
单克隆抗体的生物学功能研究
杂交瘤核型分析
单抗Ig类型鉴定
抗原位点竞争抑制试验
Western blot
血清抗体效价测定
杂交瘤技术所需的主要物品
主要仪器设备
超净工作台、CO2恒温培养箱、倒置显微镜、离心机、水浴恒温装置、冰箱、细胞混匀器、液氮罐、酶标测定仪、荧光显微镜或流式细胞仪等。
其它主要器械
培养器皿及其它96、24孔培养板、培养瓶、离心管、平皿、保温杯、培养液过滤装置、不锈钢网及手术剪刀、镊子等。
主要试剂
1) 牛血清:
实验前必须对不同来源及批号的血清进行仔细的筛选检查,筛选出能支持单细胞生长或使细胞迅速增殖的胎牛或新生小牛血清;。
购买来的牛血清,使用前最好进行灭活处理。
2)培养基
DMEM、RPMI 1640 及无血清培养基等。
DMEM有高糖(4500mg/L)及低糖(1000mg/L)之分。
3)HT及A母液(x100) ; 4)HAT及HT培养液
5)聚乙二醇(PEG)溶液;6)8-氮鸟嘌呤溶液
7)福氏佐剂
plete Freund’adjuvant,CFA)
和福氏不完全佐剂(plete Frend’adjuvant,IFA)