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在印度,巴基斯坦和英国出现的新的抗生素耐药机制的分子、生物学和流行病学的研究
介绍
来自临床和非临床的细菌对传统抗生素的耐药性逐渐增加。10年前关注的革兰氏阳性,us ,现在临床的微生物学家逐渐认识到多重耐药的革兰氏阴性菌对公众健康造成最大的危害。不仅仅是革兰氏阴性耐药菌的数量比革兰氏阳性耐药菌增长的快,而且现在很少有新的或在研的针对革兰氏阴性菌的抗生素,同时在未来10到20年内药物发展计划不足以提供足够的药物治疗革兰氏阴性菌感染。
革兰氏阴性菌耐药性的增加是由于在质粒上移动基因从而通过细菌的数量来扩散。标准的质粒型测试方法增加了我们认识移动基因的宿主范围和野生分布。另外,非惯例的人类空间旅行和移民是细菌质粒或菌落快速的传播到其他国家和大陆上。这些传播大多数不能被检测,人类正常菌运载耐药菌质粒,并且当它们成为内源性的感染源的时候才被发现。例如,20世纪中期在印度第一次发现CTX-M-15加强型广谱β-内酰***酶(ESBL),而它是由blaCTX-M-15基因编码。这个基因从的它天然宿主—Kluycera spp跳跃到能广泛扩散的质粒上,形成CTX-M-15成为全球主要的ESBL,主要导致肠杆菌对第三代头孢产生获得性耐药性。
最近的研究证实在印度70-90%的肠杆菌都有ESBL(即使这些统计可能片面,但这也说明问题的严重性),这让广泛保守使用抗生素(碳青霉烯类)成为一种可能。
头孢耐药性在其他国家发生的概率很低,但是ESBL产生菌的繁殖速度足够使碳青霉烯类抗生素失效。因此,在肠杆菌里对碳青霉烯类耐药菌有一种选择压力。这种耐药菌的出现是全球公共卫生的焦点,因为很少抗生素的保守超过碳青霉烯类抗生素。目前在美国、希腊、以色列,将KPC 碳青霉烯克隆到Klebsiella pneumoniae 成为主要的问题。同时,在希腊编码VIM metallo-碳青霉素酶的质粒已经扩散到Klebsiella pneumoniae。
我们最近报道一种新型的碳青霉素耐药基因,命名为blaNDM-1。我们从一个病人体内同时分离到带有blaNDM-1的Klebsiella pneumoniae和E -1基因,在体外的细菌中很容易转染,这个病人在印度新德里就医后被遣送回瑞典。我们在印度、巴基斯坦以及英国搜集分子生物学和流行病学的数据,主要在新德里metallo-β-内酰***酶1(NDM-1)阳性肠杆菌中搜集。
方法
细菌分离
分离的细菌在印度Chennai和Haryana鉴定。英国分离的菌株的鉴定从转介抗生素耐药性,并参考2003年和2009年间英国微生物实验室实验室。我们还鉴定了来自孟加拉国,印度和巴基斯坦附近的其他地点的分离菌。
过程
细菌身分是通过Phoenix自动表型的身分阳离子标准(Becton Dickinson公司,英国牛津)或API20E条(bioMerieux,Basingstoke,UK)。通过microbroth dilution(phoenix),英国社会抗微生物化疗(BSAC)琼脂稀释法和盘扩散建立最小抑菌浓度(MICs)和碳青霉烯类耐药性。
Modified Hodge(三叶草)测试降解的碳青霉烯类抑制区和用光盘进行的亚***培南-EDTA联合测试,或MBL E测试法(AB bioMerieux,Solna,Sweden)用来筛选metallo-β-内酰***酶
产物。利用特异性的PCR引物鉴定blaNDM-1的存在。利用PCR和测序鉴定分离的细菌的其他耐药基因(blaCMY-4和blaCTX - M-15)。
接合转移抗生素耐药性到实验株大肠杆菌J53无选择的血琼脂平板上。培养18小时后,从盘上洗涤混合的培养物,生理盐水中重悬,重新涂布于含叠氮化钠(100毫克/升)和美罗培南(2毫克/升)onkey琼脂平板上。PCR分析含有blaNDM-1的接合子。随后提取质粒,利用Carattoli和其同事的方法确定最初的起始复制区域。
在琼脂块上准备基因组DNA并利用限制性内切酶XbaI(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)酶切分析。在CHEF-DR Ⅲ仪器(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上利用脉冲场电泳(PFGE)分析DN***段。14℃,6V/cm,,结束脉冲时间30秒脉冲20小时。菌株关联聚类使用BioNumerics 软件。
琼脂糖块中的基因组DNA限制性内切酶S1(Invitrogen,Abingdon,UK)酶切分析。DN***段如上用PFGE分离。用标记32P(Stratgene,herland)的blaNDM-1探针进行凝胶杂交. 从胶中切下被blaNDM-1探针杂交到的质粒DNA带,纯化