1酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的克隆表达.doc

题目酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的克隆表达
姓名傅超宇
专业应用生物科学
课程名称基因与蛋白质工程


在酿酒酵母中编码与乙醇代谢相关的乙醇脱氢酶基因有五个基因ADH1-ADH5,其中乙醇脱氢酶Adhlp、Adh3p、Adh4p和Adh5p在糖酵解过程中还原乙醛生产乙醇,而Adh2p则催化乙醇氧化为乙醛,当外界环境中的葡萄糖消耗殆尽后,Adh2p主要负责催化利用乙醇作为碳源的初始反应。酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ是酿酒酵母中重要的乙醇氧化酶,它能够将乙醇氧化成乙醛,在乙醛脱氢酶的作用下转变成乙酸,最后转变成乙酰辅酶A 进入三羧酸循环。本研究克隆了酿酒酵母乙醇脱氢酶2 基因,并在大肠杆菌中进行表达,期望能够得到有活性的ADH2,为进一步研究乙醇的有效分解奠定基础。


(YPD培养基),30℃,培养16~18h;
,室温下,1500×g离心5~10min收集菌体;
,1500×g离心5min;
 SCED(1mol/L 山梨醇、10mmol/L  柠檬酸钠、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT二硫苏糖醇)溶液重悬,加入30μl 10mg/ml溶菌酶(Lysozyme)37℃温浴1h;
 2%SDS混匀,-20℃冰冻,然后室温震荡溶解,反复3次;
  5mol/L KAc(pH )轻轻混匀,然后10000r/min离心5min;
 离心管中,加入2倍体积的乙醇,轻轻混匀,室温放置5min后12000r/min离心10min;
,将沉淀溶解在300μl TE(10mmol/LTris-HCl,,1mmol/L EDTA,) 中,加入6μl RNase (10mg/ml),37℃温浴30min;
***仿各150μl 充分混匀,然后10000r/min离心5min;
 离心管中,加入1/()和等体积的异丙醇,-20℃放置20min后12000r/min 离心10min;
,加入300μl 70%乙醇漂洗沉淀一次,10000r/min 离心5min;
,用20μl TE溶解酵母DNA。
PCR扩增
的eppendorf 管依次加入:
浓度
35l H2O
5l 10XPCR反应缓冲
4l 25mmol/L MgCl2
4l 4种 dNTP
上游引物(引物1)
下游引物(引物2)
模板DNA()
TaqDNA聚合酶(约2单位)
/
/
/
各200umol/L
10~100pmol
10~100pmol
~2ug
2单位
引物序列:
正义链: 5'--3';为KpnⅠ酶切位点。
反义链: 5'-GCT-3'。为Xho