酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的克隆表达.docx

题目酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的克隆表达姓名傅超宇专业应用生物科学课程名称基因与蛋白质工程 1. 研究背景 研究目的在酿酒酵母中编码与乙醇代谢相关的乙醇脱氢酶基因有五个基因 ADH1-ADH5 , 其中乙醇脱氢酶 Adhlp 、 Adh3p 、 Adh4p 和 Adh5p 在糖酵解过程中还原乙醛生产乙醇,而 Adh2 p 则催化乙醇氧化为乙醛,当外界环境中的葡萄糖消耗殆尽后, Adh2p 主要负责催化利用乙醇作为碳源的初始反应。酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ是酿酒酵母中重要的乙醇氧化酶, 它能够将乙醇氧化成乙醛,在乙醛脱氢酶的作用下转变成乙酸,最后转变成乙酰辅酶 A 进入三羧酸循环。本研究克隆了酿酒酵母乙醇脱氢酶 2 基因,并在大肠杆菌中进行表达,期望能够得到有活性的 ADH2 ,为进一步研究乙醇的有效分解奠定基础。 2. 研究方法 酵母基因组 DNA 的提取 接种酵母到 酵母试管培养基中(YPD 培养基), 30 ℃, 培养 16 ~ 18h ;(可事先由老师帮助进行培养) 取 酵母培养液,室温下, 1500 ×g 离心 5~ 10min 收集菌体; 菌体用灭菌水洗 1 次, 1500 ×g 离心 5min ; 菌体用 200 μl SCED(1mol/L 山梨醇、 10mmol/L 柠檬酸钠、 10mmol/L EDTA 、 10mmol/L DT T 二硫苏糖醇) 溶液重悬,加入 30 μl 10mg/m l 溶菌酶(Lysozyme)37 ℃温浴 1h ; 加入 100 μl 2%SDS 混匀,- 20 ℃冰冻,然后室温震荡溶解,反复 3 次; 向悬浮液中加入 150 μl 5mol/L KAc(pH ) 轻轻混匀,然后 10000r/min 离心 5min ; 将上清转移到一新的 离心管中, 加入 2 倍体积的乙醇, 轻轻混匀, 室温放置 5min 后 12000r/min 离心 10min ; 除去上清, 将沉淀溶解在 300 μl TE(10mmol/LTris-HCl , , 1mmol/L EDTA , ) 中,加入 6μl RNase (10mg/ml) , 37 ℃温浴 30min ; 加入饱和酚和***仿各 150 μl 充分混匀,然后 10000r/min 离心 5min ; 转移上清到新的 离心管中,加入 1/2 体积的 () 和等体积的异丙醇,- 20 ℃放置 20min 后 12000r/min 离心 10min ; 除去上清,加入 300 μl 70% 乙醇漂洗沉淀一次, 10000r/min 离心 5min ; 风干除去乙醇,用 20 μl TE 溶解酵母 DNA 。(以上第一次实验可以完成) PCR 扩增 的 eppendorf 管依次加入: 浓度 35 ?l H2O 5 ?l 10XPCR 反应缓冲 4 ?l 25mmol/L MgCl2 4 ?l4种 dNTP ?l 上游引物(引物 1) ?l 下游引物(引物 2)