细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养).doc

,细胞状态如何,细胞密度如何,决定是否传代。观察时拧紧盖子。、versene、培养基,(提前做好)瓶子不要倒着放,不要让液体接触到瓶塞。(先开风机,后开照明),用75%乙醇清洁台面,点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒,如果废液太多,可以用其他容器先装废液。取小离心管一个,置于架子上。、吸量管各一支,放置在专用的架上。放置的方式,注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。。打开versene,用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些,不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候,尽量平稳,不要让试剂碰到瓶口。,置离心管中,吸量管加入versene,然后将versene瓶收起来。(加versene主要是为了将旧培养基洗去)。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。,然后将versene弃掉。换新管,用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后,尽快放平,使细胞消化时间一致。。放孵箱2min,收胰酶,。使用二次消化法,去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。,镜下观察消化情况。消化程度合适之后(细胞变圆,但不漂起),用尖吸管弃去胰酶,取离心管中的培养基加入细胞,吹打,至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞,versene对细胞有毒性,且不能被血清中和。然后吸取至离心管中,800rpm离心5分钟。。,用吸新培养基的管弃去上清,先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量,加入离心管,小体积混匀,将细胞重悬,尖吸管吹匀。,用枪吸10ul的液体,计数。不要把枪伸到离心管内。,加入新的培养皿中。镜下观察,摇匀,放入37度孵育。收超净台。293T细胞 培养条件:37℃,5% CO2,~,无菌恒温培养。 细胞相关操作:细胞复苏1. 37°C水浴预热培养基(DMEM+10% FBS);2. 从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻(解冻后不要继续暖细胞);3. 在超净台中加入5ml培养基重悬细胞,1000rpm离心5min;4. 弃上清,加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中,轻轻晃匀;5. 置于37°C,5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧);,用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。细胞传代1. 当细胞融合度达到90%以上时,给细胞传代;2. 37°C水浴预热培养基(DMEM+10% FBS);3. 在超净台中,弃培养基,加入2-5mlPBS清洗细胞后,再加入1ml胰酶消化细胞;4. 显微镜下观察到细胞变圆,有细胞开始脱离瓶壁时,加入5ml培养基(DMEM+10% FBS)终止消化;,并轻轻吹打将细胞吹散;,1000rpm离心5min;,加入15-20ml的培养基(含血清)重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中(确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间),细胞密度在1×104 cells/cm2 (×10