动物细胞培养总结!-!!!.doc

动物细胞培养总结
实验准备
实验器械、器皿的清洗和消毒
（1）清洗和包装
离心管(，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。
蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。
取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。
过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。
过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。
玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。
消毒灭菌
1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。
2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。
玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。
无菌间消毒及设备检查
用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。
配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。
用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。
检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。设置温度和二氧化碳。
紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。
细胞培养用液的配置及分装
RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰***和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.
胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。
5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水， NaHCO3溶于水后，过滤除菌。
%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。
双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。
操作步骤
注意事项：
1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。
2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。
3、