基因工程第二章基因工程的基本操作程序.ppt

基因工程第二章基因工程的基本操作程序
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(Target DNA)制备
制备DN***段可通过5个途径：
1、从生物基因组群体中分离目的基因
2、人工合成
3、PCR反应合成DNA
4、mRNA差异显示法获得目的基因
5、机械的方法如超声波把基因组打成片段
目的基因是指准备导入受体细胞的，以研究或应用为目的所需要的外源基因。
片段来源：原核生物和真核生物
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1、从生物基因组群体中分离目的基因
主要有以下几种方法：
限制性内切酶法（鸟枪法）
mRNA或cDNA钓取法（反转录法）
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A 鸟枪法（霰弹法）
美国塞莱拉遗传公司创始人雷格·文特发明的，是20世纪最伟大的生物技术发明之一。
鸟枪法是将基因组打成小片段进行测序，然后再利用计算机对这些片段进行排序和组装，重新组装成一个完整的基因组。
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
鸟枪法操作的改进
鸟枪法克隆目的基因的局限性
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鸟枪法克隆目的基因的基本战略
随机克隆供体细胞的全基因组DN***段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。
鸟枪法适用于原核
细菌目的基因的
克隆分离
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染色体的切断
与载体连接
转化受体细胞
筛选含目的基因的重组子
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
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1、染色体DNA的切断
超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端
全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接,  但有可 能使目的基因断开，大小不可控
部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端， 目的基因完整
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与载体连接
如果采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；
如果采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
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如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；
如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞
转化受体细胞
筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
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鸟枪法操作的改进（一）
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。
如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
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