质粒dna的提取—碱变性提取法_图文.doc

山东大学生命科学学院 08 级生命基地 2010 年 10 月 31 日星期日[质粒 DNA 提取] [ 碱变性提取法] [ 栾一] [ 山大南路 2 7 号] 质粒 DNA 提取-碱变性提取法 2 /17 质粒 DNA 的提取—碱变性提取法实验目的: 。 DNA 的方法。仪器和材料; 恒温振荡培养箱,高速冷冻离心机,漩涡振荡器; 离心管, 50ml 离心管;不同型号的的枪尖等。菌体: α受菌体,具有 AMP r标记的质粒 PUC19 。实验试剂: LB 培养基,抗生素,溶液 I,溶液 II,溶液 III, RNase A母液, TE 缓冲液, 饱和酚等。试验原理: 碱裂解法是较常用质粒的提取的方法。其优点是收获率高,适于多数的菌株, 所得产物经纯化后可满足多数的 DNA 重组操作。该方法操作简单,易于操作, 一般实验室均可进行。十二烷基磺用于进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠( SDS )是一种阴离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性。用 SDS 处理细菌后,会导致细菌细胞破裂,释放出质粒 DNA 和染色体 DNA ,两种 DNA 在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同, 变性时前者虽然两条链分离,却仍然缠绕在一起不分开;但后者完全变性分甚至出现断裂,因此,当加入 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值,使溶液 pH 值质粒 DNA 提取-碱变性提取法 3 /17 恢复较低的近中性水平时, 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构, 但是主染色体 DNA 则难以复性。在离心时,大部分主染色体与细胞碎片,杂质等缠绕一起被沉淀,而可溶性的质粒 DNA 留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤,可得到纯化的质粒 DNA 。碱裂解法提取的质粒 DNA 可直接用于酶切、 PCR 扩增、银染序列分析等. DNA 粗提取所用的三种溶液: 溶液 I, 50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA , pH ; 溶液 II, M NaOH / 1% SDS ; 溶液 III,3M醋酸钾/2M醋酸; 溶液 I: 任何生物化学反应,首先要控制好溶液的 pH ,因此用适当浓度的和适当 pH 值的 Tris-Cl 溶液,是再自然不过的了。加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此,如果溶液 I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响。所以说溶液 I中葡萄糖是可缺的。 EDT A 是 Ca2+ 和 Mg2+ 等二价金属离子的螯合剂, 配在分子生物学试剂中的主要作用是:抑制 DNase 的活性, 和抑制微生物生长。在溶液 I中加入高达 10 mM 的 EDTA ,无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA , 只要是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕 DNA 会迅速被降解, 因为最终溶解质粒的 TE 缓冲液中有 EDTA 。如果缺少溶液 I,只要用等体积的水, 或 LB 培养基来悬浮菌体就可以了。不过菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。质粒 DNA 提取-碱变性提取法 4 /17 溶液 II: 是用新鲜的 N的 NaOH 和2 %的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH 稀释制备 的 NaOH ,是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO 2 而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱,而不是 SDS ,所以才叫碱法抽提法。事实上 NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞, 碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这是由于细胞膜发生了从 bilayer (双层膜) 结构向 micelle (微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的 N NaOH ,即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌,自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒,因为 SDS 也是碱性的,只是弱了点而已。这一步要记住两点:第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组 DN A 片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。溶液 III: 它加入后就会有大量的沉淀,大量沉淀的出现,显然与 SDS 的加入有关系。如果在溶液 II 中不加 SDS 会怎样呢,也会有少量的沉淀,但量上要少得多,显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。在 1 %的 SDS 溶液中慢慢加入 5N的 NaCl ,你会发现 SD S 在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SD S 的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl 而是 KCl