异养硝化细菌的分离筛选与特性测试.doc

南昌大学实验报告学生姓名: 冯涛学号: 5802112013 专业班级: 环境工程 121 班实验类型: √验证□综合□设计□创新实验日期: 实验成绩: 异养硝化细菌的分离纯化及其硝化特性的测定实验设计一、实验目的: 1. 从活性污泥中中分离培养异养硝化细菌, 掌握常用的分离和纯化方法; 2. 认识并了解本实验培养基的组成; 3. 掌握 FISH 试验验证所分离的硝化细菌,掌握氮轨迹跟踪试验来测试分离筛选的纯化菌株在好氧条件下的硝化性特性能力。二、实验基本原理: 废水生物脱氮是目前水处理领域中关注和研究的热点, 其中对异养硝化作用及其菌属的研究,是对传统硝化理论的丰富与突破。相对于自养硝化菌而言,虽然有的异养菌的分解效率较低,但是由于它们在环境中的数量以及生长速率上往往远大于自养菌,因此在某些环境之中,异养硝化作用的贡献可以与自养菌相当,甚至超出。关于异养硝化作用,虽然目前仍有很多机理未得到解释,对一些现象的解释也不尽圆满,但异养硝化作用的重要性日益受到关注。本实验在膜生物反应器(Membrane Bioreactor , MBR) 实现稳定高效同步硝化反硝化(SimultaneousNitrification and Denitrification , SND) 效果的基础上,采用将传统微生物学方法与现代分子生物学手段相结合的新型异养硝化细菌分离筛选方法,对系统中异养硝化细菌进行了分离筛选,通过生理生化实验、 16S rDNA 序列分析, 对分离筛选获得菌株进行了分析。同时采取批式实验对分离菌株的异养硝化性能进行了进一步的试验研究,为开发设计新的脱氮工艺,提高脱氮效率,提供一定理论及技术基础。三、主要仪器设备及耗材: 1. 无菌物品: 包括各种玻璃器皿, 锥形瓶, 移液管, 牛肉膏- 蛋白胨固体培养基,酒精灯等; 2. 恒温振荡器,接种环,超声波仪,荧光共焦激光扫描显微镜; 3. 玻璃珠,无菌水,蒸馏水, 50% , 80% , 98% , % 酒精。四、实验步骤: 材料与方法 菌种来源取自运行稳定且具有 % SND 效果的 MBR 系统 异养硝化细菌的分离筛选 分离平板牛肉膏- 蛋白胨固体培养基, 其配方为: 牛肉膏 10g/L , 蛋白胨 10g/L , NaCl 5g/L ,琼脂 15~ 20g/L 。 样品的稀释吸取 MBR 中活性污泥 20mL 加入到盛有 180mL 的无菌蒸馏水和玻璃珠( 分散用)的 500mL 三角瓶中,塞上灭菌的棉花塞,于恒温振荡器上以 100r/min 转速 30℃下振荡 10h , 而后进行 10 倍浓度梯度稀释至 10 的负十次方。 细菌的纯化分离在制备好的牛肉膏一蛋白胨固体培养基上, 从各个稀释度的稀释液里均取 0. 1mL 分别稀释涂布至固体平板上( 每个稀释度 3 个重复), 于生化培养箱 30℃下培养。在形成菌落的平板内, 挑选出大约 100 个单菌落的平板。将单菌落用接种环挑出,划线分离。待形成菌落后,再用接种环移植到固体培养基上, 30℃条件下培养,然后挑取一接种环的细菌菌苔放到无菌水中,充分振荡。用此细菌悬液,按照活菌数测定方法在平板上涂布,使其在培养皿上形成 30~ 50 个单菌落,而后把单菌落按照上述方法再