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microRNA ( miRNA )引物设计及过程原理说明 microRNAs 的平均长度 23nt 左右,所以 miRNA 引物设计与常规引物设计存在很大差别,以下讲解一下整个 miRNA 引物设计的过程加上实验流程,以帮助大家对各方面的学****首先,引物设计之前先介绍 miRNA 反转录合成 cDNA 的过程。我们拿经典颈环序列 GAGGTATTCGCACTGGATACGAC 作介绍。打开 DNAsta r软件的 PrimerSelect ; fil e打开下拉菜单;打开En ter New Primer …;粘贴颈环序列;点击 OK。颈环结构已经输入,下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。选择颈环结构(鼠标点一下);点击 Repor t下拉菜单;选择 Primer Hairpins 。第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-) 。下面结合 has -miR-122-5P 合成 cDNA 的具体过程讲解 has -miR-122-5P : UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU 将U转T ,方便后面使用: TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT miRNAs 的颈环结构引物:是将 miRNAs 的3’端后 6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的 3’端形成的结构。(自己根据后面图片想一下原因,加 6个碱基为经验所授) has -miR-122-5P 的后 6位: GTTTGT has -miR-122-5P 的后 6位的反向互补序列: ACAAAC 颈环引物序列: 5’- GAGGTATTCGCACTGGATACGAC ACAAAC -3’查看形成的发夹结构(方法前面有讲) 看一下 miRNA 和颈环引物在一起会是怎么样子: 在含反转录酶及适当的条件下, miRNA 和其颈环引物将会合成 cDNA 链: AT A 查看 cDNA 结构: 我们知道了 cDNA 的合成过程和序列,同时学****了 miRNA 的反转录过程。下面进入重头戏,教大家如何进行 miRNA 引物设计。首先如果你的前面实验是芯片的就在 miRbase 上再查看核对一遍,如果是测序实验的需要将 miRNA 的名字 3p或 5p及之前的部分复制到 miRAN 上查找完整序列。将得到的 miRNA 完整序列复制到一个 excel 表中, 然后使用查找替换将 U改为 T (一定要记住改换, 要不然 是不认 U的)。为了后面引物设计方便,需要以 miRNA 序列构建引物,所以需要将 miRNA 的 cDNA 的反向互补序列找出。使用 。打开 File 下拉菜单; New ; DNA Sequence 。由于正规设计过程中不会先把 cDNA 序列找出来,所以直接操作过程为先将 miRNA 序列( U改T)输入,再输入颈环结构序列的反向互补序列。复制 miRNA 序列(U改T);点击 序列框,使用组合键“ Ctrl+V ”粘贴序列;选择正向序列。复制颈环结构序列;点击 序列框,使用组合键“ Ctrl+V ”粘贴序列;选择反向互补序列输入 plemented 。到这一歩 cDNA 的反向互补序列已经输入完毕,下一歩是在 上进行引物设计。 9个N(这个是