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3酶工程山东师范大学
第二章 酶与细胞的固定化
固定化生物技术——
通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。
，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影 TEMED
2）微囊型包埋法
（microencapsulation）
又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。
半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：
1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。
2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。
缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：
优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。
缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法

酶的四种固定化方法
固定化方法
吸附法
包埋法
共价结合法
交联法
物理吸附法
离子吸附法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收
高，酶易流失
高
高
低
中等
再生
可能
可能
不能
不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性
不变
不变
不变
可变
可变
各种固定化方法的优缺点比较
分类方式
固定化细胞
分类方式
固定化细胞
细胞类型
微生物
植物
动物
生理状态
死细胞:完整细胞,细胞碎片, 细胞器
活细胞:增殖细胞,静止细胞, 饥饿细胞
（二）细胞的固定化方法

1) 直接固定法
不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。
一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法
3)包埋法
2. 固定化方法
例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一种胞内酶。在50--80℃加热10分钟，使菌体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然保持活性，长期使用酶活力不减少。
微生物细胞
植物细胞
动物细胞
吸附法
吸附力较弱，细胞易脱落

 
包埋法
 


实验：
%左右的卡拉胶 ，70 ℃溶解, 再冷却到 42℃, +10%左右的细菌菌体(预热到42℃）

迅速混合均匀
4 ℃冰箱放置大约30min
取出后切成3×3mm的小颗粒
一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。
注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。
（三）原生质体的固定化方法
第二节  固定化酶和固定化细胞
的性质与表征
一、固定化酶的性质
影响酶催化活性的因素
1. 构象改变或立体屏蔽以及微扰
2. 分配效应和扩散限制效应
（一）酶的活性 ：
通常低于天然酶（有例外）。
（二）酶的稳定性
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。
可能的原因：
①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，
可防止酶分子伸展变形；
②抑制酶的自身降解。
③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶
的侵袭。
如：氨基酰化酶，
70℃，15分钟，酶失去活性。
而固定化后， 70℃，15分钟，有>80%活性。
（三）酶的最适温度
最适温度与酶稳定性有关。
多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。
（四）酶的最适pH
带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。
带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移。
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电