氨基酸分析样品的水解处理.doc

氨基酸分析样品水解用于氨基酸分析的样品制备要得到满意的氨基酸分析结果,不仅仅要注意样品的制备,最重要的是样品的处理。最精密的仪器也只是在分析时从样品中分离出氨基酸本来的含量。下面的制备方法已经过实践验证,适用于常规分析。但在某些情况下也可以,或者说有必要,做适当的修改。含缩氨酸或蛋白质的样品制备方法: 水解样品需要预先粉碎并过 60 目筛,如果样品含有油脂成分, 则水解前还必须先萃取。方法一、用 6 mol/L 盐酸水解纯蛋白质或缩氨酸 1、称取含蛋白 -25 mg 的样品(约 50- 100 mg ,准确至 mg )于 20mL安培管中(切勿粘壁); 2、加入 10mL 6mol/L HCL (取 500 mL优级纯盐酸( 36-38% ),定容到 1000 mL, 加1g苯酚); 3、用液氮冷冻; 4、待液体超过三分之一凝固后,抽真空,熔化安培管使其密封; 5、根据样品的不同,将其放在 110 ℃的炉子(烘箱)上,水解 12、 24、 36或 72h; 6、为了保证结果的重现性,应使炉子恒定在 110 ℃,建议使用内置气流环路的炉子; 7、水解完成后,冷却,混匀,开管,过滤,定容至 50 mL ; 8、取适量( mL 左右) 滤液置于浓缩仪或旋转蒸发仪中,低于 60℃,抽真空, 蒸发至干,必要时加少许水,重复蒸干 1-2次; 9、加入 1-3 mL 样品稀释液, 使氨基酸浓度达到 50-250 nmol/mL 。震荡混匀, 用 μm滤膜过滤后,供上机测定使用。注意: 称取样品的量最好与氮的总含量相关联,这样分析结果的重复性会更好。除此之外的另一个重要因素是样品量与所加入的酸的比例。当样品中不含纯的缩氨酸和蛋白质而是含有碳水化合物时,酸的多少就非常重要。碳水化合物的量越多,所需酸就越多。样品与酸的比例必须在 1:10 到 10:1 的之间(mg/mL) 。方法二、氧化水解 1、称取含蛋白 -25 mg 的样品(约 50-100 mg ,准确至 mg )于 20 mL 浓缩管中(切勿粘壁); 2、置于 0℃冰水中加入 2 mL 预冷的过甲酸溶液,加液时需将样品全部润湿,但不能摇动; 3、在2℃的冰箱中放置 15h;或者 55℃水浴中放置 15 min ; 4、溶液中多余的过甲酸可以通过加入氢溴酸( 48%氢溴酸 mL )放入冰浴静止30 min 来去除; 5、然后置于浓缩仪或旋转蒸发仪中,低于 60℃,抽真空,蒸发至干; 6、用 10-15 mL 6 mol/L HC L将残渣转移到20mL 安培瓶或厌氧管中(切勿粘壁), 封口(无须抽真空),置于( 110 ±1)℃恒温干燥箱中水解 22-24h; 7、水解完成后,冷却,混匀,用水把水解液定容到 20 mL ; 8、过滤后取 mL 上清液浓缩至干; 9、加入 1- 3 mL 样品稀释液, 使氨基酸浓度达到 50- 250 nmol/mL ,震荡混匀, 用 μm滤膜过滤后,供上机测定使用。注意: 在氧化过程中,酪氨酸将被完全破坏,而组氨酸被部分破坏; 制备过甲酸(过蚁酸)溶液(过甲