4离体叶绿体对染料的还原作用及叶绿素浓度的测定.docx

中国海洋大学实验报告 20 15年 11月3日姓名白杰年级 2014 专业生物科学同组者曹昱课程植物生理学实验题目离体叶绿体对染料的还原作用及叶绿素浓度的测定一、实验目的 1 、学会叶绿体的提取 2 、了解离体叶绿体光合放氧活性的测定方法和光合作用的机理 3 、了解光合作用和还原能力生成之间的关系二、实验原理(一)离体叶绿体对水的光解作用 1、叶绿体的分离提取叶绿体是光合作用的主要细胞器,将叶绿体的提取液放入含有铁***化钾的反应介质中, 在照光条件下,叶绿体光解水并放出氧气。?????????? 222 3eFOOH Fe 叶绿体,光照叶绿体的提取是在 0~5℃条件下,在叶绿体提取介质的保护下,通过研磨法破碎细胞, 再通过差速离心得到叶绿体提取液。 2、离体叶绿体对水的光解作用 Clark 氧电极是由嵌在绝缘棒中央的铂电极和位于周围的银电极组成,银电极为正极,铂电极为负极。两极间以 ***化钾为电解质。电极顶端被一层 15~20 μm 厚的聚乙烯或聚四***乙烯薄膜封闭,将电极和被测溶液隔离,以排除外界待测液的干扰。溶解氧能透过薄膜进入电极。当外加一定的极化电压时,溶解氧透过薄膜在阴极还原,电极反应式: O 2 +2H + +2e====H 2O 2 叶绿体的放氧速率可通过溶解氧测定仪进行。根据温度恒定时,电流大小与待测液中氧浓度成正比,可以测定放氧速率。 Clark 氧电极产生的样电流讯号经放大后可由记录仪记录测定。(二) 离体叶绿体对染料的还原作用离体叶绿体在照光的条件下,可以将水分解并放出氧气,同时将 2,6—二***酚吲哚酚染料还原,使其从蓝紫色变成无色,这一变化在短时间内呈现线性关系。叶绿体的分离一般在等渗溶液和一定的 pH 条件下进行,本实验在 和 值为 的 Tris 缓冲液中制备,以减少渗透压对叶绿体的伤害,通过研磨, 离心取得叶绿体的悬浮液。整个过程在 0℃-5℃下进行, 所有提取物溶液和材料也应保存在该温度下,分离后测定工作应尽快进行。三、仪器试剂 1 、仪器及用品研钵、台式离心机、试管、试管架、离心管、移液管、冰浴缸、分光光度计、纱布。 2 、试剂(1 )叶绿体提取介质: 的 NaCl 溶液。(2) 叶绿体反应介质: Tris-HCl 缓冲液, pH 值为 ;( 其它试剂本实验未使用) (3 )叶绿体浓度测定: 86% *** 3 、实验材料新鲜菠菜叶片五、实验步骤实验内容实验现象及数据(备注) 1. 叶绿体的分离: 1 )取健康、新鲜的菠菜叶子洗净擦干,去柄及粗脉称 5g 鲜重,加入 15ml 的 NaCl 溶液, 的 Tris 缓冲液及少量石英砂, 在冰浴中研磨成匀浆。 2 )将研磨好的匀浆用 4 层纱布过滤到一离心管中, 1000rpm 离心 2 分钟, 弃沉淀, 上清液转入另一离心管。(此叶绿体提取液应放入冰浴中保存) 2 、叶绿素浓度的测定: 取 1mL 叶绿体提取液(剩余的提取液仍放到 0℃保存),同 9mL86% ***混合, 2000rp m 离心沉淀 5 分钟。去掉残渣后, 上清液为叶绿素提取液,用 1cm 光径的比色杯测定其 nm 652A 值。 A