SOD酶活力测定实验.doc

摘要: 通过对绿豆种子的研磨破碎获得 SOD 粗酶, 经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程, 除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白, 采用葡聚糖( Sephadex G-100 ) 凝胶层析得到纯化的 SOD 酶。跟踪提纯过程活性的分布, 并评价提取过程各步骤的效率。实验结果证实随着不断的分离提纯, 总活力以及总蛋白不断减小, 比活力不断上升, 最终得到的结果为总纯化倍数为 ,活性得率为 % 。一、前言: 超氧化物歧化酶简称 SOD , 是一种新型酶制剂,属金属酶。分布很广,几乎从哺乳动物到细菌,以及植物中均存在。在微生物中主存于需氧菌。 SOD 是催化超氧阴离子( O 2 - )歧化反应的酶类, 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(O 2.-), 生成 H 2O 2和O 2 .H 2O 2 由过氧化氢酶( CAT ) 催化生成 H 2O和O 2, 从而减少自由基对有机体的毒害。它的存在与生物体内的解毒作用有关,也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。自 1968 年发现 SOD 后, 立刻引起科学界的高度重视,近 40 年来这方面的研究进展非常迅速, 它的应用领域日益拓宽, SOD 也有了产品. 国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶, otein. otein 的药理性质, 证明它无毒, 无抗原性, 能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。二十世纪 80 年代后期,我国关于 SOD 的研究及应用也形成了热点,如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。 SOD 作为治因而受到医药界的关注。目前中国国内已进入临床试验阶段。本实验以绿豆为原料提取 SOD ,通过各步的分离提纯,应测得酶总活力逐渐减小,比活逐渐升高. 通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程,以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。二、实验材料与方法: <一> 材料: 绿豆种子, 市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水 24 小时备用. <二> 试剂: 葡聚糖( sephadexG-100 ), NaCl ( AP), 磷酸氢二钠( AP), 磷酸二氢钠( AP), 三羟***氨基甲烷( Tris ), 盐酸( 浓盐酸), 硫酸铵( AP), PEG6000 , 考马斯亮蓝 G250 , 磷酸,乙醇( 95% ), 牛血清蛋白 BSA , 连***( 焦性没食子酸), EDTA( 钠盐), 超氧化物歧化酶( sigma 公司)。<三> 仪器: 离心机,紫外分光光度计,柱层析装置,玻璃层析柱,匀浆机,各型号烧杯、试管、量筒,带毛塞试管,漏斗,移液枪, 移液管,玻璃棒,电子天平等。<四> 实验方法和步骤: 25g 绿豆, 洗涤,蒸馏水浸泡过夜,加入 250 ml pH7 mol/L pb 液,匀浆机匀浆,两层纱布过滤,离心( 3000 rpm )得清液,取少量清液作为样 1 进行 SOD 活性测量,计算材料中 SOD 总活性单位及比活性单位( units/mg Pr )。 2. 所得清液测量总体积, 缓慢加入硫酸铵至 35 %饱和度, 浓度为 ,4℃冰箱静置分层。 3. 离心( 3000rpm ) 取清液,取少量为样②,测量 SOD 活性、蛋白质含量测量,计算 SOD 总活性单位及活性单位。 4. 步骤 3 中的清液