低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖活性和NO分泌的影响.doc

1 低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖活性和 NO 分泌的影响作者:马彦卓,许旭东,韩凯,李飞,曹艳杰,张荣庆, 王海昌【摘要】目的: 观察不同作用时间下低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞( EPCs ) 增殖活性和 NO 分泌的影响. 方法: 密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,培养4d 后收集贴壁细胞,每日给予低频脉冲电磁场干预,磁场强度 mT ,频率 15 Hz. 按作用时间的不同分为对照组(0h )和磁场作用时间组( ,2,4,8h组) ,各组细胞培养及磁场干预3d后, 分别采用 MT T 比色法测定 EPC s 的增殖活性, 流式细胞仪检测细胞周期, Griess 法检测培养上清中 NO 水平. 结果: 对照组 A490 nm 为( ± ), h组( ± ),2h 组( ± )与对照组( ± )相比差异无统计学意义( );4h组 A490 nm 值开始增加[ ( ± ) vs( ± ); ],8h 组较对照组增加最为明显[ ( ± ) vs( ± ); ]. h 组, 2h 组细胞增殖指数 PI( S+G2M )%与对照组相比差异 2 无统计学意义( ),4h组,8h 组细胞增殖指数与对照组相比差异均有统计学意义( ). NO 分泌随磁场作用时间的延长, 其分泌增加. 结论: 低频脉冲电磁场可影响 EPC s 的增殖及 NO 分泌,随着作用时间的延长,细胞增殖及 NO 分泌增加. 【关键词】电磁场; 内皮祖细胞; 细胞增殖;一氧化氮 0 引言内皮祖细胞(endothelial progenitor cells , EPCs) 作为治疗性血管形成的研究靶点, 已发现其不仅参与血管形成, 也参与出生后血管生成[1]. 低频脉冲电磁场作为一种外来干预手段,已发现其可促进内皮细胞修复,促进内皮细胞 FGF 的分泌, 提示低频电磁场对血管形成具有促进作用[2]. 我们采用体外培养大鼠骨髓 EPCs, 观察低频脉冲电磁场不同作用时间下骨髓 EPCs 增殖能力和 NO 分泌的变化及其时效关系, 并探讨其相关作用机制, 材料和方法 3 材料健康雄性 SD 大鼠 30只, 体质量 80~ 100 g(第四军医大学实验动物中心) ;脉冲电磁场发生仪(第四军医大学生物医学工程系); Ficoll 淋巴细胞分离液( 中国医学科学院生物工程医学研究所) ;胎牛血清(美国 Hyclone 公司) ;血管内皮生长因子(VEGF) ,成纤维细胞生长因子( bFGF ) (澳大利亚 CYTOLAB 公司); FITC 标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC 拟 UEA 拟I, 美国 Sigma 公司); DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI 拟 acLDL , 美国 Molecular Probe 公司);NO 试剂盒( 南京建成生物工程研究所); 激光共聚焦显微镜(美国 Bio 拟 Rad 公司) . 方法 的分离、培养与鉴定[ 2-3 ] 将大鼠颈椎脱臼处死后, 取四肢骨用 750 mL/L 乙醇浸泡 10 min ,用 5 mL 注射器抽取培养液冲洗骨髓液, 密度梯度离心法获取单个核细胞, 将其接种予培养瓶中,在 M199 培养基(含 100 mL/L FBS , VEGF 10μ g/L , bFGF 5μ g/L ,L拟谷氨酰*** 300 mg/L , 青霉素1× 105U/L ,链霉素 100 mg/L ,肝素 × 104U/L) 中培养, 差异贴壁法培养 4h 后,吸取上清置于新的培养瓶中继续培养4 d. 将培养 4d 的细胞消化, 接种于盖玻片上, 24h 后将细胞爬片行 Dil 拟 ac拟 LDL 与 FITC 拟 UEA 拟I 直接免疫荧光 4 双染. 向细胞爬片孔内加 10 mg/L Dil 拟 ac拟 LDL , 37℃孵育 10h后, 细胞爬片经 40 g/L 多聚甲醛室温固定 10 min , PB S 漂洗后加入 10 mg/L FITC 拟 UEA 拟I 并于 37℃避光孵育 1h, PBS 洗涤同上,晾干后封片,激光共聚焦显微镜观察. FITC 拟 UEA 拟和 DiI 拟 acLDL 双染色阳性细胞为正在分化的 EPCs. 实验分组 PEMFs 发生仪频率 15 Hz, 磁感应强度:0~ mT 可调,线圈直径 200 mm. 调整两线圈距离至 100 mm. 将线圈放