真菌感染实验诊断课件.ppt

第三章真菌感染实验诊断
第一节 真菌的基本特性
真菌是一大类具有典型细胞核，不含叶绿素，不分根、茎叶的真核细胞型微生物。
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一、真菌的形态特性
（一）单细胞真菌呈圆形，如酵母菌。
（落颜色 病原性真菌颜色淡，
污染真菌颜色深；
④致病性真菌菌落下沉，有时使
培养基开裂；污染性真菌菌落
不下沉,很少引起开裂。
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三、真菌的生化反应
用于主要深部感染真菌如假丝酵
母菌、隐球菌等。
(醇)类发酵试验 37℃孵育，
观察糖发酵情况。
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含菌生理盐水
与已融化的固体同化碳源培养
基(45℃)混合，然后在培养基
上分别加糖，置25℃孵育观察
结果。若24h后无变化可重复
加糖。如能同化周围有生长圈，
否则无生长。
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同化碳源试
验相同，但需用无氮源的培
养基，不要加糖类，而加入
***钾。
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四、动物实验
实验的目的是分离病原性真菌、
确定真菌菌种的致病性、研究药物
对真菌的作用等。如假丝酵母菌接
种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀，
肾皮质部位有白色脓疡。
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五、核酸检测
医学真菌的鉴定手段引入了分子生
物学的鉴定方法，从核酸碱基G+C
mol％分析、限制性片段长度多态
性(RFLP)、Southern印迹分析到脉
冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR指纹、
随机扩增多态性DNA(RAPD)以及DNA
特殊片段测序等。
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（一)G+Cmol％分类鉴定法
常用热变性温度法。原理是DNA加热变性使碱
基氢键被打开，双链螺旋变成单链，导致核
苷酸碱基在260nm紫外吸收明显增加，完全
变成单链后，紫外吸收增加停止。紫外吸收
增加的中点值温度为热变性温度（Tm）。
若真菌DNA中G+C碱基对含量多，Tm值就高。
可直接反映G +C碱基对的绝对含量。
计算公式为：G+Cmol％=(Tm-)×
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(二)真菌核型的脉冲电泳分析
脉冲凝胶电泳技术(PFGE)解决
了真菌大分子DNA的分离技术难题。
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原理：PFGE有两个方向的电场在设
定的脉冲时间里交替变换，使大分
子DNA在移动中不断改变自己的形状
及迁移方向，从而绕过细小的凝胶
孔隙而得以分离。较大的DNA分子泳
动慢些，较小的快些，有许多因素影
响电泳带型，分离真菌等大分子量的
DNA宜用较低电压和较长脉冲时间。
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用PFGE分析真菌核型，可直接比较
其遗传背景,从电泳核型差异中进行
分类鉴定,又能取得基因结构的基本
数据，构建出大尺度物理图谱。
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(三)随机扩增多态性 DNA(RAPD)分析
RAPD分析是一种利用随机合成的单个
寡核苷酸引物，通过PCR扩增靶细胞
DNA，扩增产物凝胶电泳，分析DNA
片段大小和数量的多态性，从而比
较靶基因差异的一种技术。由于病
原性真菌基因组庞大，RAPD分析适
用于真菌的鉴定与分类。
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六、真菌***的检测
真菌产生有毒的代谢产物，可引起急
慢性真菌中毒症，引起消化道中毒症
状，而且可进入人体内引起病变，如
引起肝脏损伤的黄曲霉***、杂色曲
霉***；引起肾脏损害的桔青霉素；
引起中枢神经系统损害的黄绿青霉素
等。甚至有的***具有致癌性，如黄
曲霉***与肝癌发生有关。
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检测真菌***有许多方法，如检测
黄曲霉***有生物学方法和ELISA法
等。生物学方法主要用于检测真菌
***的毒性，如用鸡胚、小白鼠作
毒性试验，观察动物中毒死亡或出
现肿瘤。ELISA法操作简便，并具有
安全快速高效、费用低，适用于大
批量标本的筛选。
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