新型DNA-AgNCs在谷胱甘肽临床体外诊断中的应用研究.doc

新型DNA-AgNCs在谷胱甘肽临床体外诊断中的应用研究
【摘要】 目的:以DNA为模板制备的水溶性银纳米簇(AgNCs)具有合成简单性质温和的特点,为拓展其在临床体外诊断中的应用,开展本次研究。方法:从四种缓冲液和三种DN具有重要生理功能的天然活性肽,在体内有还原型和氧化性两种形态。还原型谷胱甘肽(glutathione reduced,GSH),具有清除自由基、解毒、保护肝脏、提高免疫力及抗癌等诸多作用,其半胱氨酸上的巯基是发挥其生物学功能所不可缺少的功能基团。谷胱甘肽的检测可以为病毒性肝炎、脑类疾病、免疫系统疾病等的诊断提供依据[7]。本研究首先探索了AgNCs的合成,由于温和地制备水溶性AgNCs并不容易,笔者选择以DNA为合成模板,并筛选了最佳的性质温和的缓冲体系,研究合成后的DNA-AgNCs作为体外诊断试剂在检测GSH中所发挥的作用。
1 材料与方法
一般材料
(1)***银(AgNO3)(购于Sigma公司);(2)醋酸铵(CH3COONH4,NH4Ac)(购于Sigma公司);(3)脱氧核糖核酸(DNA)模板链(购于Sangon上海分公司,经PAGE纯化),DNA1:5’-TTCCCACCCACCCCGGCCCGTT-3’;DNA2:5’-TATCCGTCCCCCACGGATA-3’;DNA3:5’-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3’;(4)硼氢化钠(NaBH)(购于aladdin公司);(5)磷酸二氢钠(NaH2PO4)(购于Sigma公司);(6)磷酸二氢钾(KH2PO4)(购于Sigma公司);(7)磷酸氢二钠(Na2HPO4)(购于Sigma公司);(8)***化钾(KCl)(购于Sigma公司);(9)***化钠(NaCl)(购于Sigma公司);(10)GSH(购于Sigma公司);(11)氧化型谷胱甘肽(Glutathione oxidized,GSSG)(购于Sigma公司)。 方法
DNA-AgNCs的合成 4个不同的DNA合成组(1~4号分别为H2O对照组、DNA1模板组、DNA2模板组、DNA3模板组)分别加入H2O、PBS、低浓度NH4Ac(10 mmol/L NH4Ac)、高浓度NH4Ac(80 mmol/L NH4Ac)四种不同的缓冲体系中,再向体系中加入AgNO3溶液,三者充分混匀后放置于4 ℃冰箱中孵育20 min。随后向反应体系中加入NaBH4混匀,放置于4 ℃冰箱中反应1 h。反应完成后取样品测定其荧光强度,剩余样品在凝胶成像仪中拍照,随后放入冰箱中保存。
荧光检测方法 实验中,银纳米簇的荧光光谱用F7000荧光光谱仪检测,光谱仪的检测参数设置为:激发光波长570 nm, nm,发射光范围580~800 nm, nm,激发光电压为900 V。
GSH的检测 取DNA-AgNCs与不同浓度的GSH和GSS***溶液等体积混合,混匀后将反应体系避光静置5 min,测定其荧光光谱。
2 结果
本研究选择了一种耗时较短的合成方法,按缓冲体系的不同分为四组,通过凝胶成像仪拍摄的结果图1中可以看出,在10 mmol/L