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生化实验报告模版.doc

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生化实验报告模版.doc
文档介绍:
生物化学实验报告
姓名: 郭玥

学号: 3120100021

专业年级: 2012级护理本科

组别: 第8实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
(Title of Experimetn)
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定
实验日期
(Date of Experiment)
2013-12-11
实验地点(Lab No.)
第8实验室
合作者(Partner)
黎真秀郭项萍德吉
指导老师(Instructor)
宋千成
总分
(Total Score)
96
教师签名(Signature)
宋千成
批改日期
(Date)
     
【实验报告第一部分(预习报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):XX】
实验目的:1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法
2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法
3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法
4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法
5、了解柱层析技术
实验原理:1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别,可分离纯化各种蛋白质。
盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。
离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
醋酸纤维素薄膜电泳原理:血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
实验材料:人混合血清葡聚糖凝胶(G-25)层析柱
DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液
醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸
1%BaCl2溶液氨基黑染色液
漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液
电泳仪、电泳槽
实验流程:盐析(粗分离)→葡聚糖凝胶层析(脱盐)→DEAE纤维素离子交换层析(纯化)→醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴定)
实验步骤:
盐析+凝胶柱层析除盐:
取血清0.8ml,边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml,混匀室温放置10min,4000r/min离心10min
上清液(含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)
沉淀(含球蛋白)加水 0.6ml溶解
过葡聚糖凝胶G-25层析柱(1.0×7cm)
过葡聚糖凝胶G-25层析柱(1.0×7cm)
用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱,流出液量约1ml时开始检测蛋白质
用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱,流出液量约1ml时开始检测蛋白质
磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质
收集含有蛋白质的峰液12滴
收集含有蛋白质的峰液12滴
继续用 2ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤
继续用2ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤
BaCl2检测SO42-阴性 BaCl2检测SO42-阴性
用2-3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡
用2-3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡
离子交换层析(纯化):
除盐后收集的球蛋白
过DEAE-纤维素层析柱(1.0×6cm)
用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(3ml)洗脱,流出液量约1ml开始检测蛋白质
取浓度最高的1管作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)
磺基水杨酸检测蛋白质
收集含有蛋白质的洗脱液每管10滴,连续收集3管
除盐后收集的清蛋白
过DEAE-纤维素层析柱(1.0×6cm)
DEAE-纤维素柱不用再生,可直接用于纯化清蛋白
用1ml 0.06mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约5mL 0.06mol/L NH4AC缓冲液流洗,除去α球蛋白和β球蛋白
磺基水杨酸检测蛋白质
收集含有清蛋白的洗脱液每管10滴,连续收集2管
DEAE-纤维素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶液流洗,再用10ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液流洗再生平衡
2管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)
(三)醋酸纤维素薄膜电泳:
1、点样(如下图):
- 点样线+
2cm
点样区(粗面)
1.5cm
点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多
2、电泳:
①薄膜粗面向下
②点样端置阴极端
③两端紧贴在滤纸盐桥上,膜应轻轻拉平
电压:110V
时间:50min
3、染色和漂洗:
电泳完毕后,关闭电源,将膜取出,直接浸于染色液中5min。
取出膜,尽量沥净染色液,移入漂洗液中浸洗脱色(一般更换2次),至背景颜色脱净为止。
取出膜,用滤纸吸干即可。
注意事项:
1、所用血清应新鲜,无沉淀物及细菌滋生。
2、使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。
3、上样时,滴管应沿柱上端内壁加入样品,动作应轻、慢,勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。
4、洗脱时应注意及时收集样品,切勿使蛋白质峰溶液流失,并注意层析柱不要流干,进入空气。
5、切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆,因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。
6、葡聚糖凝胶价钱昂贵,要回收再生,避免损耗,严禁倒掉!
【实验报告第二部分(实验记录):①主要实验条件(如材料的来源、质量;试剂的规格、用量、浓度;实验时间、操作要点中的技巧、失误等,以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据);②实验中观察到的现象(如加入试剂后溶液颜色的变化);③原始实验数据。评分(满分20分):XX】
主要实验条件:
1、0.3mol/LpH6.5醋酸铵(NH4AC)缓冲液:称取NH4AC 23.12g,加蒸馏水800ml溶解,滴入稀氨水或稀醋酸液(注意混合均匀),调节pH至6.5后,补加蒸馏水至1000ml。
2、0.06mol/LpH6.5 NH4AC缓冲液:取上液用蒸 内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.