农杆菌感受态细胞的制备.pdf

实验一 农杆菌感受态细胞的制备
［目的及要求］
了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
［实验原理］
在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工
程菌株。
在基因工
二、试剂：液氮
YEB 液体培养基（1L）：酵母提取物 1g，牛肉膏 5g，蛋白胨 5g，蔗糖 5g，
MgSO •7H O ，，高压灭菌。
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YEB 固体培养基：每升 YEB 液体培养基加 15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：50mg/ml
利福平（Rif）储液：50mg/ml
YEB 固体培养基平板（Kan 抗性）：灭菌后的 YEB 固体培养基待其温度降至
50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度分别为 100µg/ml和 50µg/ml，
混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
［实验步骤］
1、在 200µl 感受态细胞中加入 2－6µl 质粒（pBI121）DNA，冰浴 5min，液
氮中速冻 5min；
2、迅速转入 37℃水浴中，热激 5min；
3、加入 1ml YEB 液体培养基， 28℃慢速振荡培养 2－4 小时；
4、3000rpm 离心 4min，去一部分上清，留取 200µl 菌液涂布于含有 50µg/ml
Kan 和 50µg/ml Rif 的 YEB 平板；
5、放置约 ，待水份干后， 28℃培养约 24 小时至长出菌落。
实验三 农杆菌转化子的鉴定
［目的及要求］
掌握农杆菌质粒 DNA 的提取方法。将从农杆菌提取的质粒与对照质粒同时电
泳，通过比较确定获得了农杆菌转化子。
［实验原理］经改造的 Ti 质粒（只含有帮助 T-DNA 跳到植物染色体上的 Vir 区）存在于
农杆菌工程菌株中，含有 T-DNA 的双元载体（Binory Vectors）完成重组后可以
在大肠杆菌中扩增，再转入农杆菌中。从抗性培养基上筛选得到的农杆菌转化子
中应携带转入的重组质粒，而对照菌株则没有。
碱裂解法是一种应用最为广泛的质粒 DNA 提取方法，该法用于从小量培养物
中抽提质粒 DNA，比较方便、省时，提取的 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、
PCR 甚至测序。提取质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异
而使其分离。当细胞在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，在 pH 高达 的碱性