中药大辞典附编(第二版)(南京中医药大学 编著) 部分7.pdf

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实验二引物设计及测序结果分析
目的:
1、掌握常规引物设计的原则及操作流程。
2、熟悉简并引物设计的原理及操作方法。
3、熟悉引物设计软件及在线引物设计工具的操作方法。
4、掌握使用相关软件及在线工具分析测序结果的方法。
内容:
1、使用Primer Premier、Oligo、BLAST等软件及在线工具进行常规引物设计,并对引物扩增效率、特异性进行评价。
2、使用DNAMAN软件进行常规引物快速设计。
3、使用NCBI中的在线引物设计工具Primer-BLAST快速设计引物。
4、使用在线工具CODEHOP设计简并引物。
5、使用Chromas、BioEdit软件查阅测序结果峰图文件。
6、使用DNAMAN软件对测序序列进行编辑,进行序列拼接。
软硬件要求:
联网计算机,预装Windows 7操作系统,预装IE或Chrome浏览器、英汉电子词典(有道词典或金山词霸),预装DNAMAN7、Primer Premier5、Oligo7、Chromas、BioEdit等生物信息学分析软件。
操作及问题:
一、Primer Premier5、Oligo7、BLAST常规引物设计
本部分操作将使用Primer Premier5、Oligo7、BLAST等软件及工具设计拟南芥AtBADH基因编码区全长特异引物。(参考“第四章引物设计及测序结果分析”课件)
(一)使用Primer Premier5搜索引物
1、在NCBI数据中查找登录号为NM_001198470的序列记录,查阅相关信息,并
下载序列将其保存为fasta格式文件。
问题1:该序列是什么类型的序列?该序列编码区在什么位置?
2、打开Primer premier5软件,点击file→new→DNA sequence,使用快捷键ctrl+ank窗口中(或者点击file→open→DNA sequence,选择上一步保存的文件并打开)。
3、ank窗口中左上角的Primer按钮,在弹出的Primer premier窗口中点击Search,在弹出的Search Criteria窗口中根据要求选择合适选项及参数,选定后,点击OK,如弹出的Search Progress窗口中有OK按钮选项,点击OK,弹出Search Results窗口;如没有出现OK按钮,则改变引物筛选条件及参数重新搜索引物。
4、点击Search Results窗口中某对引物,在Primer premier窗口中查看选中引物的详细信息,初步判断引物质量。
5、点击程序主窗口中Edit→Copy,将选中引物保存在新建文档中,供后续步骤继续分析。
(二)使用Oligo7评价引物
1、打开Oligo7软件,点击File→Open打开基因序列(即NM_001198470),或点击File→New sequence粘贴基因序列,熟悉窗口中各项功能。
2、点击菜单Edit→Forward Primer,将Primer premier5设计的一条上游引物粘入弹出窗口,点击√接受输入,点击Edit→Upper Primer选中该引物作为上游引物。同理点击菜单Edit→Reverse Primer,将Primer premier5设计的一条下游引物粘入弹出窗口,点击√接受输入,点击Edit→Lower Primer选中该引物作为下游引物。
3、依次点击菜单Analyze中的Key Info、Duplex Formation、Hairpin position and Tm、False Priming Sites,查看软件对所选引物对的评价。
4、点击菜单Analyze中的PCR,查看软件对该对引物的PCR反应的归纳。
5、依次将Primer premier5设计的各对引物载入Oligo进行评价,选择合适的引物。如未能发现完全满足要求的引物,可通过在引物末端去掉一个不满意的碱基或加上一个碱基,再对其评价分析是否可用。
(三)使用在线BLAST分析引物特异性
1、打开NCBI BLAST程序页面(),点击Basic BLAST下面的nucleotide BLAST,进入新页面。
2、在Enter Query Sequence下面的框内连续输入上游引物、20个以上的N、下游引物的反向互补序列,在Choose Search Set下面Datebase后选择Others,点击下方BLAST按钮开始运行程序。
3、根据BLAST结果分析该对引物的特异性,如果匹配的序列均为该基因的同源基