RTPCR详细图文分析.docx

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一、及时荧光定量PCR原理
(一)定义:在PCR反响系统中加入荧光基团,利用荧光信号积累及时监测整个PCR
进度,最后经过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
(二)及时原理
1、老例PCR技术:
对PCR扩增反响的终点产物进行定量和定性分析没法对初步模板正确立量,没法对扩增反响及时检测。
2、及时定量PCR技术:
利用荧光信号的变化及时检测PCR扩增反响中每一个循环扩增产物量的变化,经过Ct
值和标准曲线的分析对初步模板进行定量分析
3、如何对初步模板定量?
经过Ct值和标准曲线对初步模板进行定量分析.
4、几个看法:
(1)扩增曲线:
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(2)荧光阈值:
3)Ct值:
CT值的重现性:
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5、定量原理:
理想的PCR反响:X=X0*2

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n
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非理想的PCR反响:X=X0(1+Ex)n
n:扩增反响的循环次数
X:第n次循环后的产物量
X0:初始模板量
Ex:扩增效率
5、标准曲线
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6、绝对定量
1)确立未知样品的C(t)值
2)经过标准曲线由未知样品的C(t)值计算出其初始量
7、DNA的荧光标志:
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二、及时荧光定量PCR的几种方法介绍
方法一:SYBRGreen法
(一)工作原理
1、SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光
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3、变性时,DNA双链分开,无荧光
4、复性和延长时,形成双链DNA,SYBRGreen发荧光,在此阶段收集荧光信号。
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PCR反响系统的成立及优化:
1、SYBRGreen使用浓度:太高克制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测
2、Primer:引物的特异性高,不然扩增有杂带,定量禁止
3、MgCl2的浓度:,以减少非特异性产物
4、反响Buffer系统的优化
5、反响温度和时间参数:由酶和引物决定
6、其余与老例PCR同样
(二)应用范围
1、初步模板的测定;
2、基因型的分析;
3、融解曲线分析:能够优化PCR反响的条件,对老例PCR有指导意义,如对primer
的议论;能够划分单调引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
(三)长处及弊端
长处:对DNA模板没有选择性;适用于任何DNA;使用方便;不用设计复杂探针;
特别矫捷;廉价。
弊端:简单与非特异性双链DNA结合,产生假阳性;但能够经过融解曲线的分析,优
化反响条件;对引物特异性要求较高。
方法二:TaqMan---水解型杂交探针
5′端标志有报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等
3′端标志有荧光淬灭基团(Quencher,Q)
探针完好,R所发射的荧光能量被Q基团汲取,无荧光,R与Q分开,发荧光
Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性,可水解探针
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(一)工作原理
注意:每扩增一条DNA分子,开释一个荧光信号,能够在循环过程中任一点检测荧光
PCR反响的成立:
1、引物、探针的设计:
探针Tm为68-70℃,<30bp,5不’能有G,G可能会淬灭荧光素,引物尽量凑近探针,扩增片段<400bp,引物Tm为59-60℃
2、反响参数的确定:
一般为:94℃,10-20S
60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高)
也可经过温度梯度优化退火温度72℃,45S,
3、优化引物和探针浓度:获取最小Ct值,信号/背景比值的最大值
引物浓度:50-900nM
探针浓度:50-250nM
4、其余与老例PCR同样
(二)优弊端
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长处:
对目标序列的高特异性
------阴性结果确立
设计相对简单
------与目标序列某一地区互补
重复性比较好
弊端:
只合适一个特定的目标;
拜托企业标志,价钱较高;
不易找到本底低的探针
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