蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养与鉴定（可编辑）.doc

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蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养与鉴定

IsolationandIdentificationofMongolianSheepChorionic
TrophoblasticCellsinVitro申请人:刘慧学科门类:农学学科专业:基础兽医学研究方向:反刍动物肿瘤病病理指导教师:刘淑英教授
论文提交日期:二?一二年五月摘要
滋养层细胞是胎盘屏障的重要组成成分,对胚胎的植入过程起重要的调节
作用。本研究旨在进行体外培养、鉴定蒙古绵羊滋养层细胞(trophoblastic
cells),并对其生物学特征进行探究,来建立一种能稳定、方便地获得较高纯
度的绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法,为后续的细胞转染和RNA干扰试验提供细胞
学基础。
经过培养不同孕期(早、中、晚)的蒙古绵羊滋养层细胞,发现胎盘的采
集时间对细胞的贴壁率及细胞活性影响较大,确定采集胎盘的最佳时期为孕中
期。通过添加不同浓度的血清,筛选出含15%胎牛血清FetalBovineSerum
FBS的高糖DMEM培养体系较适合细胞生长。细胞培养初期,通过胰酶消化差速
法,去除上皮样细胞中混杂的成纤维状细胞,并在5代之内得到纯化的细胞。应
用伊红-苏木素染色法(HE),可观察到纯化的细胞形态多样,呈多角形或卵圆
形,细胞界限清楚,胞浆透明,核圆或呈小泡状。使用免疫组织化学方法,分
别检测不同孕期的正常绵羊胎盘绒毛组织,以及体外培养的滋养层细胞,结果
显示,培养的滋养层细胞中细胞角蛋白呈阳性表达,波形蛋白呈阴性表达,证
明细胞的纯度在90%以上,符合后续实验的要求纯度。应用透射电子显微镜观察
绵羊绒毛膜滋养层细胞,观察结果显示,所培养的细胞具有滋养层细胞的典型
结构,细胞表面有丰富的微绒毛,细胞质内线粒体较多,并可见电子密度较高
的脂滴,细胞核较大,细胞间可见缝隙连接结构,提示所培养细胞为绵羊绒毛
膜滋养层细胞。利用RT-PCR技术检测滋养层蛋白-1,结果显示,纯化的细胞能
够表达滋养层蛋白-1。
研究结果表明,本试验应用组织块培养法制备原代滋养层细胞,该方法简
便易行,可以有效获得较高纯度的,且具有生物学活性的绵羊绒毛膜滋养层细
胞,为本实验室后续的体外研究提供细胞学基础。
关键词:蒙古绵羊;滋养层细胞;细胞培养;逆转录聚合酶链式反应;免疫组
织化学;透射电镜IsolationandIdentificationofMongolianSheep
Chorionic
TrophoblasticCellsinVitro
AbstractAimedtostudyMongoliansheeptrophoblastcellsinvitroandidentification,and
toexploreitsbiologicalcharacteristics,tocreateastable,easyaccesstohigh-purity
sheepchorionictrophoblastcellsforsubsequentcell
transfectionandandRNA
interferenceexperiments,providedacytologicalbasisDevelopdifferentstagesofgestationearly,middleandlateMongoliansheep
trophoblastcellsandfoundthattheplacentacollectiontimeinfluencedtherateof
adherentcellsandcellactivity,theplacentacollectionperiodforthesecondtrimester
,
foundcontaining15%FetalBovineSerumFBSfetalbovineserumculturesystemis
better,.Theearlyofcellsculture,weuseddifferenttrypsindigestiontimetoremove
thefibrouscellsmixedamongtheepithelioidcellsandpurificationwithin5
-hematoxylinstainingHEcanbeobservedinthe
purifiedcells,whichhavediversepolygonal,oval,
havetransparentcytoplasm,
immunohistochemicalmethodwasusedtodetectthedifferentpregnancyandnormal
sheepplacentalvilli,
positiveexpression,vimentinnegativeexpression,provedthepurityofthecellsmore
than90%,andcansatisfiedwiththefollow-
transmissionelectronmicroscopeobservingsheeptrophoblastcells,theresult
indicatesthattheculturedcellswithtypicaltrophoblastcellsstructureof,manymicrovillisonthecellsurface,mitochondriaandthehighelectrondensityoflipid
dropletsaremorevisibleinthecytoplasm,nucleiislarger,gapjunctionstructure
betweenthecells,suggestingthattheculturedcellsisthesheeptrophoblastcellBy
RT-PCRdetectedoftrophoblastprotein-1,foundthepurifiedcellswereableto
expresstrophoblast-protein-1Theresultsshowedthatthistestusedtissueculturemethodtocultureprimary
cells,whichissimple,effectivetoobtainhighpurityandbiologicalactivityofsheep
trophoblastcells,canprovideexperimentalbasisinfollow-upvitroresearch
experimentsinourlaboratory
KeyWords:Mongoliansheep;Trophoblasticcells;Cellculture;
Transcriptionpolymerasechainreaction;Immunohistochemistry;
Transmissionelectronmicroscopy
Directedby::Liuhui(TheElementaryVeterinaryScience)
AnimalScienceandAnimalMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot010018,China目录
1引言1










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、活性的影响26


-PCR检测的结果30



致谢39


TritonX-100(Octylphenol-polyethylenglycolether聚乙二醇辛基苯基醚
PP13placentaprotein13胎盘蛋白13STBM(syncytiotrophoblast
microvillousmembranes合体滋养细胞微绒毛膜DMEM(dulbecco`smodified
eaglemedium杜氏改良培养基
HLAhistocompatibilityleukocyteantigen组织相容性抗原
CKCytokeratin细胞角蛋白
OTP-1Ovinetrophoblastprotein-1绵羊滋养层蛋白IFN-τInterferon-τ,干扰素-τ
TGFtumorgrowthfactor肿瘤生长因子
IL(Interleukin白细胞介素
D-PBS(Dulbecco`sphosphatebufferedsaline杜氏磷酸缓冲液
PGE2Dinoprostone前列腺素E2
DMSO(deimethy1sulphoxide二***亚砜
FBS(fetalbovineserum胎牛血清
hCG(humanchorionicgonadotrophin)人绒毛膜促性腺激素
EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid乙二***四乙酸
TE(Trypsin-EDTA胰蛋白酶-EDTA内蒙古农业大学硕士学位论文1
1引言
研究发现,胎盘是有重要生理学功能的器官,它能够进行胎儿母体间的物质交
换,分泌一些激素进入胎儿体内及防御外源病源入侵等。胎盘滋养层细胞是构成胎
盘保护屏障的主要细胞,并对胚胎的植入起重要的调节作用,它还具有重要的内分泌
功能。要反映生物体内的真实情况,原代培养的滋养层细胞被认为是最好的细胞模
型,为研究内源性病毒通过胎盘屏障进入胎儿体内的机制,及对胎盘的影响提供细
[1]
胞学基础。
目前,国内对于绵羊绒毛膜滋养层细胞研究的报道比较少,还未建立起成熟的
[2]
绵羊滋养层细胞系。本研究借鉴并改良了国内外学者有关绵羊滋养层细胞
的原代
培养体系,以寻求建立稳定的、可靠的、易行的绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养
[3]
体系。

细胞滋养细胞较强的增值能力,能够不断形成新的滋养层细胞,可以相互融合
为合体滋养细胞。合体滋养细胞具有内分泌活性,是动物体正常细胞中唯一的侵袭
细胞,是行使功能的细胞。它位于母体胎儿交界的胎盘绒毛表面,是母体胎儿循环
屏障的主要组成成分之一。细胞滋养细胞的侵袭过程类似于肿瘤细胞,在胚泡着床
[4]
及胎盘的形成方面,均具有关键的作用。
,承担转运各种营养物质、
激素、生长因子等的功能,经受体介导的细胞转运系统把被动免疫转运到胚胎。
STBM在阻止外源性病毒菌侵入、限制性药物等能否通过胎盘屏障进入胚胎循环方
面起了重大作用,营养物质和废物穿过STBM运输的调控则是经调节其顶端和基底
膜中的运载体的极性来表达的,有些运载体的极化则表达在靠近母体界面的质膜位
[5]
置上。

这种细胞具有单核的不规则形状和细微地分散染色质并且占滋养层细胞总数的
80%。(图1)它们的细胞质适度密集,主要是位于顶端的部分细胞,有卵球形或
狭长型的线粒体,具有高密度基质和一定数量的脊。高尔基体小,定位于细胞质的
一侧。邻侧质膜在一些区域以复杂的方式表现出罕见的交织和桥粒,有不同程度的
分化。靠近母体组织的膜有发育良好的连接复合物。立方细胞可以分为两种:占大部分的一类细胞含有和上述一致的细胞器和位于2蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养与鉴定
细胞侧部的粗面内质网。另一类占少数,通常聚集成团,含较少的粗面内质网和数
目较多的不同形状的深染颗粒,并且有些细胞处于变性性改变。大的颗粒可能变形
成核。在这两种细胞间还有一些过度态的细胞。图1成熟的立方上皮细胞(摘自Boshier等1977)
:bm:基底膜;fc:胎儿毛细血管;ms:母体合胞体细胞

双核巨细胞占整个滋养层组织的20%,通常单独存在于立方上皮细胞间。(图
2)这些细胞不在基底膜和胎儿-母体连接部。它们总是被立方上皮细胞质的连续的
薄片包围,这使得它们从母体合胞体和胎儿结缔组织完全分离。它们有两个大的,圆的核,每个核有1或2个小核仁和成群的染色质。线粒体,
类似于那些立方上皮细胞,散布整个细胞质,尽管它们通常有一少部分位于细胞的
一侧。细胞质比立方细胞密度高,含有很多短的,膨大池的粗面内质网,大的高尔
基体复合物。这些细胞的质膜没有典型立方上皮细胞所有的复杂交叉或者明显的桥
粒结构。双核细胞通常或含有一定数目的包膜微粒或糖原颗粒。内蒙古农业大学硕士学位论文3图2双核上皮细胞(摘自Boshier等1977)

注:CE:立方上皮细胞

胎盘的形成是成功怀孕的先决条件,在受精后,胚胎植入需要滋养层的分
[6]
化,同时将胚胎细胞迅速组装成为一个具有功能的胎盘。