使用生长因子组合的骨髓干细胞和间充质干细胞之骨生成分化的制作方法.docx

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专利名称:使用生长因子组合的骨髓干细胞和间充质干细胞之骨生成分化的制作方法
技术领域:
本发明涉及骨髓干细胞(bonemarrowstemcell,BMSC)和间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)的骨生成分化方法,涉及可由所述方法获得的细胞和细胞群,还涉及其用途特别是在骨治疗领域中的用途。
背景技术:
移植能够进行骨生成分化的干细胞或者定向于骨生成分化的细胞是治疗骨相关疾病(特别是当所述治疗需要新骨产生时)的有前景的途径。先前已使用骨髓干细胞(BMSC)和间充质干细胞(MSC)治疗骨疾病(Gangji等,2005,ExpertOpinBiolTher5:437-42)。然而,尽管可以将这些相对未分化的干细胞进行移植,但是它们并不定向分化为骨生成谱系,因此这样移植的干细胞中有相当大的比例最终可能不会形成期望的骨组织。而且,可从骨髓或其它来源组织获得的这些干细胞的量常常不能令人满意并且在多种环境下还可能减少,例如由使用糖皮质激素或滥用酒精或遗传原因所致。WO2007/093431公开了一种使分离的BMSC或MSC在体外充分扩增并获得已显示出成骨表型之细胞的方法。在所述方法中,人
BMSC或MSC在血清或血浆以及碱性成纤维细胞生长因子(FGF)存在下培养。WO2007/093431未教导使用特定的FGF和TGF生长因子组合用于获得成骨细胞并且未提示其任何优点。需要另外的简单可靠的方法用于从BMSC和MSC产生可用的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。特别期望这些方法可实现更大程度的细胞扩增和/或产生具有额外有利性质的细胞,例如在同种异体对象中导致较低组织排斥的细胞。本发明的一个目的是提供这样的方法以及由此获得的成骨细胞表型细胞。发明概述本发明人发现,当在血清或血浆、成纤维细胞生长因子(FGF)以及转化生长因子β(TGFB)存在下进行培养时,成体干细胞(更具体地,骨髓干细胞(BMSC)和间充质干细胞(MSC))的扩增潜力可在骨生成分化后大大增加,由此可实现可用的骨原细胞或成骨细胞表型细胞及细胞群的数量增加。因此,在一方面中,本发明提供了用于从人骨髓干细胞(BMSC)或人间充质干细胞(MSC)体外或离体获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的方法,包括使所述BMSC或MSC与人血浆或血清、成纤维细胞生长因子(FGF)或者其生物活性变体或衍生物、以及转化生长因子β(TGFB)或者其生物活性变体或衍生物相接触。本发明的方法可以将显著部分(例如大多数)的经处理干细胞向骨原细胞或成骨细胞表型分化。因此,在一个方面中,本发明的方法可用于获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞本身。然而,应当理解,本发明的方法通常可产生骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞占显著部分
(例如大多数)的细胞群。这样的细胞群任选地可包含其它细胞类型。因此,在一方面中,本发明涉及用于从人BMSC或人MSC体外或离体获得包含骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞之细胞群的方法,包括使所述BMSC或MSC与人血浆或血清、FGF或者其生物活性变体或衍生物、以及TGFB或者其生物活性变体或衍生物相接触。本发明方法允许产生用于移植目的的大量骨生成细胞。这使得进一步减少了为获得初始BMSC或MSC细胞而需要从对象取出的组织的量。其还允许从对象中获得具有减少的BMSC或MSC细胞数的足够量的骨生成细胞。同时,所述方法使得缩短了经分化细胞可移植进患者的时间,因此导致治疗更快捷。在一个实施方案中,本发明的上述方法可包括以下步骤(a)从包含BMSC或MSC的人对象生物样品中回收细胞;(b)任选地,从(a)中回收的细胞分离单个核细胞;(c)将(a)或(b)的细胞添加至包含人血浆或血清、FGF或者其生物活性变体或衍生物以及TGFB或者其生物活性变体或衍生物的培养基,并培养该细胞_培养基混合物,从而使细胞贴附至基底表面;(d)除去未贴附物,并继续在(C)中所限定之培养基中培养贴附细胞,从而获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞样细胞,或者包含这些细胞的细胞群。在上述任一方法的一个实施方案中,可将BMSC
或MSC细胞同时暴露于FGF和TGFB,或者暴露于其生物活性变体或衍生物。在上述任一方法的另一些实施方案中,所述人血浆或血清可以与所述BMSC或MSC细胞是自体的,或者其可以与所述BMSC或MSC细胞是同种异体的(同源的)。在上述任一方法的另一些实施方案中,在所述BMSC或MSC细胞的培养中不使用非人动物材料(例如,血清组分)。这降低了培养细胞在人体中异种排斥的风险,以及降低了病原体污染患者的风险。上述方法的另一些优选实施方案还涉及例如但不限于孵育时间、传代、组分量等的特征,这些特征单独地或组合起来还构成提供本发明之细胞和细胞群的基础。本发明人还出人意料地发现,使用本发明方法获得的成骨细胞表型细胞中HLA-DR主要组织相容性复合体的表达比使用WO2007/093431之方法观察到的HLA-DR表达显著更低。这样更低的HLA-DR表达可增强本发明获得之成骨细胞表型细胞的免疫豁免特性(immunoprivilegedcharacter),从而降低这些细胞的排斥风险并使其还能更广泛地用于同种异体患者中。因此,本发明还提供了与现有技术相比表现出新的有利特性的成骨细胞表型细胞。因而,本发明的一些方面提供了通过本发明方法可获得或直接获得的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞以及包含这些细胞的细胞群。本发明人还对本发明得到的成骨细胞进行了分析,定义了包含这些细胞的新细胞类型和细胞群,其可为治疗(特别是骨移植治疗
)提供特别的优越性。因此,在一方面中,本发明提供了具有如下特征的人骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞以及包含这些细胞的细胞群,所述细胞(1)包含⑶90、⑶105、⑶73、⑶63、⑶166和碱性磷酸酶(ALP)(更具体地为骨-肝-肾型ALP)的表达,(2)不表达⑶45、⑶14、⑶19,以及(3)少于25%的细胞、优选地少于20%的细胞以及更优选地少于15%的细胞(例如少于10%的细胞或少于7%的细胞)表达HLA-DR(即,相当大比例的细胞不表达HLA-DR)。如上提及,本发明还涉及包含本文所定义之骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的细胞群。示例性的细胞群可包含至少10%、优选地至少30%、更优选地至少50%(例如至少60%)、更优选地至少70%(例如至少80%)、甚至更优选地至少90%(例如至少95%)的如本文所定义的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。例如,所述细胞群可包含少于50%、优选地少于40%、更优选地少于30%、更优选地少于20%以及更优选地少于10%(例如少于7%、少于5%或少于2%)的除本文所定义之骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞之外的其它细胞类型。如本发明所教导地,相关方面涉及骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞或者包含这些细胞的细胞群在骨相关疾病中的治疗性用途以及包含所述细胞或细胞群的相应药物制剂。本发明的这些及其它特征在下文和所附权利要求中进一步得到解释,并通过非限制性的实例进行说明。
图1显示在含有血浆和10ng/mlTGFB-I或者含有血浆和10ng/mlFGF2及10ng/mlTGFB-I(η=4)的培养基中得到的成骨细胞原代培养物的箱线图比较。图2显示在补充有或未补充lOng/mlTGFb-I的培养基中得到的成骨细胞培养物之比较。(A)原代培养物,(B)继代培养物,(C)全体。图3显示在(A)仅FGF2或(B)FGF2及TGFb-I存在下所培养细胞的矿化情况,其通过基质茜素红(alizarinred)染色来测定。图4示意在TGFb_l/FGF2中培养的细胞对经PHA刺激之PBMC的免疫抑制作用。发明详述本文使用的无数量词修饰形式包括单数和复数含义,除非上下文另有指明。例如,“细胞”是指一种(个)或多种(个)细胞。本文所用的术语“包含”与“包括”或“含有”是同义词,并且为开放式的,不排除另外的未记述之成员、要件或方法步骤。由端点记载的数值范围包括该范围内涵盖的所有数字和分数以及所述端点。当涉及可测量值例如参数、数量、持续时间等时,本文所用的术语“约”,意在包括从指定值变化+/-10%或更少、优选地+/-5%或更少、更优选地+/-1%或更少以及更优选地+/-,在该变化范围内适于进行本发明公开内容。应理解,修饰词“约”所指的值本身也是具体且优选公开的值。本说明书中引用的所有文献均通过引用以整体并入本文中。特别地,本文中具体指出的所有文献之教导通过引用并入本文中。除非另有定义,本发明公开使用的所有术语
(包括技术和科学术语)具有本发明所属领域普通技术人员常规理解的含义。,在一方面中,本发明涉及用于从人骨髓干细胞体外或离体获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的方法,以及用于从人骨髓干细胞体外或离体获得包含骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的细胞群的方法。如本文所用地,所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞一般包括可有助于形成骨材料或骨基质的细胞或者能够发育成可有助于形成骨材料或骨基质之细胞的细胞。特别地,本发明的方法得到可用于在治疗背景下恢复骨形成的细胞和细胞群,如本发明人通过实验所证实地。因此,所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞应理解为希望涵盖由本发明方法得到的任何可如此应用的骨生成谱系细胞。骨髓是占据长骨髓腔、某些哈弗管以及松质骨(cancellousbone)或海绵骨(spongybone)之骨小梁之间空间的软组织。该术语特别地但非限制性地涵盖红骨髓(其发现于幼年的所有骨中和成年的有限位置(例如在海绵骨中)中)以及黄骨髓。总的来说,骨髓是包含造血干细胞、红细胞和白细胞及其前体、间充质干细胞(MSC)、间质细胞(stromalcell)及其前体以及包括成纤维细胞、网织红细胞、脂肪细胞在内的一组细胞和形成结缔组织网络(称为“间质(stroma)”)之细胞等的复杂组织。在小鼠和人中进行全身移植后,骨髓细胞有助于形成多种不同的组织。这种能力
可反映出骨髓中存在多种干细胞(例如,造血干细胞、间充质干细胞和/或骨髓多能干细胞)的活性。因此,本文使用的术语“骨髓干细胞”或“BMSC”是指存在于骨髓中的任何成体干细胞,以及特别地存在于或(部分地)分离自骨髓样品的任何成体干细胞。骨髓(BMSC)样品可从例如对象的髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或另一些髓质空间获得。术语BMSC还包括BMSC的后代,例如从对象之样品获得的BMSC经体外或离体增殖而得到的BMSC后代。涉及特定组分时,术语“分离”表示将该组分与待分离该组分之组合物中至少一种另外组分相分离。本文使用的与任意细胞群有关的“分离的”也暗指这些细胞群不形成动物体或人体的一部分。术语“干细胞”一般是指未特化或相对低特化并且能增殖的细胞,其能够自我更新,即可进行增殖但不分化,并且其或其后代可产生至少一种相对更特化的细胞类型。该术语涵盖了能够基本上无限自我更新的干细胞(即,其中干细胞的后代或其至少一部分基本上保留了亲本干细胞的未特化或相对低特化的表型、分化潜力和增殖能力)以及显示出有限自我更新的干细胞(即,与亲本细胞相比,其中后代或其一部分的进一步增殖和/或分化的能力可被证明降低)。例如但非限制性地,干细胞可产生可沿一个或多个谱系分化以产生逐渐相对更特化之细胞的后代,其中这些后代和/或逐渐相对更特化的细胞本身可以为本
文所定义的干细胞,或者产生终末分化的细胞(即,完全特化的细胞,其可以是终末分化的(post-mitotic))0本文使用的术语“成体干细胞”是指存在于或获得自(例如,分离自)胎儿期或出生后之生物体的干细胞。根据本发明,优选的骨髓干细胞具有产生至少骨生成(骨)谱系之细胞(例如骨生成细胞和/或骨原细胞和/或前成骨细胞和/或成骨细胞和/或骨细胞等)的潜力。优选地,本发明的至少某些骨髓干细胞还可具有产生包含在本发明方法所得细胞群中的另一些细胞(例如内皮谱系的细胞,例如内皮祖细胞和/或内皮细胞)的潜能。例如但非限制性地,具有产生至少骨生成谱系细胞之潜力的BMSC类型为间充质干细胞。本文使用的术语“间充质干细胞”或“MSC”是指中胚层来源的成体干细胞,其能够
6产生间充质谱系(通常为两种或更多种间充质谱系,例如骨细胞谱系(骨)、软骨细胞谱系(软骨)、肌细胞谱系(肌肉)、腱细胞谱系(腱)、成纤维细胞谱系(结缔组织)、脂肪细胞谱系(脂肪)和间质生成谱系(骨髓间质))的细胞。MSC可分离自例如骨髓、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮)(特别是胎儿和青少年的皮肤)、骨膜和脂肪组织。人MSC、其分离、,486,359、,811,094、,736,396、,837,,827,
740中。本领域中描述的任何MSC以及通过本领域所述任意方法分离的任何MSC均适用于本发明,只要这些MSC能够产生至少骨细胞(骨)谱系的细胞即可。术语“MSC”还涵盖了MSC的后代,例如,从动物或人对象的生物样品获得的MSC经体外或离体增殖而得到的后代。可能但非限性地,至少某些MSC还可以能够产生包含在本发明方法所得细胞群中的另一些细胞。如实施例中所示,本发明的方法涉及选择在特定培养条件下贴附于基底表面的BMSC细胞。本领域已知,可以通过选择可贴附于基底表面(例如,塑料表面)的(单个核)细胞来从骨髓(或其它来源)分离MSC。因此,不受任何假设的限制,本发明人推测在本方法中MSC可至少部分地有助于从BMSC获得成骨细胞或成骨细胞表型细胞。因此,在一方面中,本发明还涉及用于从人间充质干细胞(MSC)体外或离体获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的方法,包括使所述MSC细胞与人血浆或血清、FGF或其生物活性变体或衍生物以及TGFB或其生物活性变体或衍生物接触。MSC可包含在生物样品中(例如,在包含BMSC样品中),或者可至少部分地从其分离,如本领域已知地。而且,MSC可至少部分地分离自骨髓或者分离自除骨髓以外的包含MSC之任何合适来源,例如血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮)(特别是胎儿和青少年的皮肤)、骨膜和脂肪组织。BMSC细胞旨在涵盖其任意或所有亚型,例如但不限于“快速自我更新细胞