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专利名称:使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增的制作方法
技术领域:
本发明属于生物学和化学领域,特别是属于分子生物学领域。更具体地,本发明涉及用于扩增核酸的方法和试剂盒。
背景技术:
核酸扩增被广泛用在研究、诊断学、法医学、医学、食物科学和农业中。“现场即时测试(PointofCareTesting)”(POCT)是指在患者医疗点处或附近进行的诊断性测试,即去集中化的检查,例如可以在私人医疗实践、小医院、药店中或者甚至在事故或其它医疗紧急事件的现场或位点处或者在救护车内执行所述检查。现场即时诊断需要快速且简单的测试。因此,在基于核酸的检测方法的情况下,与已建立的但较慢的基于PCR的方法相比,快速等温扩增技术最近已变得越来越重要。PCR需要热循环,以便将双链核酸例如DNA的两条链分离开。相反,例如等温扩增方法不需要热循环仪。最杰出的等温扩增方法之一是所谓的解旋酶依赖性扩增(HDA)(例如被描述在Vincent等.(2004),EMBOreports5(8):795-800Jeong等.(2009),:3325-3336;W0-A22004/027025;W0-A22006/074334中,所有均通过参考结合于此)。HDA是基于解旋酶将双链核酸特别是DNA解旋的能力,而不需要加热或甚至热循环。在
HDA中,使用DNA聚合酶和合适的寡核苷酸引物来复制分离的DNA链。因此,HDA模拟天然的复制叉机制。HDA需要存在ATP、二价镁离子和dNTP。某些基于HDA的方法还采用单链结合蛋白(SSB)来包被置换的DNA链。事实上,取决于所使用的酶,可以在热不稳定或热稳定的反应中执行HDA方法。典型地,在25°C和50°C之间、优选在37°C和42°C之间的温度下执行热不稳定的HDA反应。相反,在超过50°C、典型地在60°C和70°C之间的温度下执行热稳定的HDA或嗜热的HDA(tHDA)反应。HDA反应选择性地扩增由两个引物限定的靶序列。HDA使用解旋酶而不是像PCR中那样使用热来将双链核酸的两条链分离开。因此,可以在单个温度下执行HDA,而不需要热循环。常规的标准HDA反应的步骤示于图1中:在第一个步骤中,通过解旋酶将双链核酸解旋,产生(部分)单链的序列。然后,引物与单链区结合。在步骤2中,聚合酶合成互补链。最后,解旋酶和聚合酶共同起作用,导致模板的扩增(步骤3)。其它等温扩增包括链置换扩增(SDA),链置换扩增是基于使用限制性酶在DNA的未修饰链上造成切口并通过核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶的作用来延伸切口处的3’末端以置换下游的DNA链。另一种等温扩增是滚环扩增(RCA),其中线性ssDNA被退火到环状ssDNA模板上,所述环状ssDNA模板是通过使用DNA连接酶连接模板DNA的两个末端而生成的。接着,使用DNA聚合酶延伸退火的引物,并生成互补模板序列的串联连接的拷贝。
RCA和SDA两者都需要初始的热变性步骤。其它等温扩增包括例如切口酶扩增反应(NEAR)和相关的指数扩增反应(EXPAR),两者都采用切口酶和聚合酶来扩增短的双链模板序列(例如被描述在vanNess等.(2003),(8):4504-4509;US-A12003/0082590;W0-A22004/022701;W0-A22009/012246;W0-A22004/067726中,所有均通过参考结合于此)。然而,所有上述等温扩增方法均需要复杂的反应方案,是相对慢的和/或仅限于相对短的模板序列。
发明内容
本发明提供了用于扩增核酸、优选双链核酸的改进的方法,所述方法克服了现有技术的这些限制。本发明的方法基于改良的HDA方法。所提供的方法比常规的tHDA快,同时具有可靠的特异性。与类似于NEAR和EXPAR的方法相比,本发明的方法可以扩增更长的模板核酸。本发明涉及在切口核酸内切酶存在下执行的HDA扩增方法。因此,在本发明的情形下,在解旋酶、合适的聚合酶、和切口核酸内切酶存在下扩增模板核酸。具体地,本发明涉及用于扩增模板核酸、特别是DNA的方法,其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增(HDA)反应、特别是嗜热的HDA(tHDA)扩增所述模板核酸,并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列,或者在
HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被弓I入到模板核酸中。可以使用包含由切口核酸内切酶识别的序列的寡核苷酸引物将由切口核酸内切酶识别的序列引入到模板核酸中。这样的引物可以包含不与模板核酸杂交但是包含由切口核酸内切酶识别的序列或其部分的5’标签序列。本发明还涉及用于扩增核酸的试剂盒,所述试剂盒包含-切口核酸内切酶,-解旋酶,和`-DNA聚合酶。本发明的方法和试剂盒可用于扩增核酸,也可用于检测核酸和/或对核酸进行定量。
图1示出了现有技术的且可商购的例如来自于biohelix/NewEnglandBiolabs的标准tHDA反应、即在切口核酸内切酶不存在下的tHDA反应的方案。图2示出了本发明的使用带标签引物的切口tHDA的具体实施方案的反应方案。图3示出了本发明的使用不带标签引物的切口tHDA的具体实施方案的反应方案。图4示出了在管扫描器中来自于实施例1的不同的实时(切口)tHDA反应的结果(扩增曲线)。图中所示的是随时间推移的原始荧光强度。图5示出了实施例1的扩增产物的熔融曲线。A)标准tHDA,B),C)。图6示出了具有扩增和电泳后的实施例1的各个反应混合物的聚丙烯酰***凝胶。A)染色前的凝胶,B)用EtBr染色后的凝胶。C)凝胶上各个条带BI至B5的内含物还被图示在图6B1至6B5中。图7示出了实施例
2的靶DNA连同所使用的引物的序列。
图8示出了反应速率对切口核酸内切酶的浓度的依赖性。图中示出的是在可以检测到显著高于背景信号的扩增子信号之前的以分钟(min)为单位的时间。在存在较低浓度的切口核酸内切酶时,比无切口核酸内切酶的反应早约5min检测到信号,表示反应更快。
图9示出了标准tHDA即无任何切口核酸内切酶的tHDA的扩增曲线(随时间推移的荧光)。在cDNA模板存在下测得三条曲线,在cDNA模板不存在下测得两条曲线。。在cDNA模板存在下测得三条曲线,在cDNA模板不存在下测得两条曲线。。对图9中示出的反应进行熔融曲线分析。在cDNA模板存在下测得三条曲线,在cDNA模板不存在下测得两条曲线。。对图10中示出的反应进行熔融曲线分析。在CDNA模板存在下测得三条曲线,在cDNA模板不存在下测得两条曲线。图13示出了反应速率对切口核酸内切酶的存在的依赖性。图中示出的是在可以检测到显著高于背景信号的扩增子信号之前的以分钟(min)为单位的时间。在切口核酸内切酶存在下,比无切口核酸内切酶的反应早约6min检测到信号,表示反应更快。图
14示出了实施例1的扩增子的一条链的序列,实施例1的扩增子是指淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)基因组的孔蛋白基因的一部分。指出了引物和探针的杂交区。(A):标准tHDA;(B):本发明的方法的使用带标签引物的切口tHDA,,由带标签引物引入的序列是斜体的。详细描述本发明提供了用于扩增并任选地检测核酸、特别是DNA的方法和试剂盒。本发明的方法基于解旋酶依赖性扩增(HDA)反应。然而,不同于现有技术的HDA反应,在本发明的扩增反应中存在切口核酸内切酶。因此,本发明的试剂盒也包含切口核酸内切酶。本发明的方法在本文中可以被称为“切口HDA”。具体地,本发明的方法和试剂盒可用于扩增和检测短DNA序列,优选小于400bp的序列,更优选小于200bp的序列,甚至更优选150bp以下的序列,最优选在70bp和120bp之间的序列。典型地,用本发明的方法和试剂盒,扩增或检测双链核酸。然而,也可以扩增和检测单链核酸,只要在实际的基于HDA的扩增开始之前用聚合酶将它们转录成核酸双链即双链模板即可。具体地,本发明涉及用于扩增模板核酸的方法,其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增(HDA)反应扩增所述模板核酸,并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列,或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被弓I入到模板核酸中。可以采用多种模板核酸、优选采用双链核酸来使用所述方法和试剂盒。典型地,用本发明的试剂盒和方法扩增和
/或检测DNA。因此,在本发明的情形下,模板核酸优选为双链核酸,更优选为DNA。例如,待扩增或检测的序列可以是线性DNA或环状DNA。DNA例如可以选自基因组DNA,例如微生物基因组DNA、病毒DNA、质粒DNA和cDNA。模板可以反转录自RNA,特别是mRNAo在本发明的情形下,“dsDNA”和“DNA”双链是指双链DNA,“ssDNA”是指单链DNA,“dsRNA”是指双链RNA,“ssRNA”是指单链RNA。还可以用本发明的试剂盒和方法扩增其它核酸,例如dsRNA或DNA/RNA杂交体。可以在HDA之前执行其它的酶促步骤例如反转录或体外转录,以形成可用的核酸。本发明要求待扩增的模板核酸中存在由切口核酸内切酶识别的序列。由于不是每个待扩增的靶序列都包含这样的切口核酸内切酶识别序列,因此,可以通过合适的引物来引入这样的序列。因此,在本发明的方法的优选实施方案中,使用包含由切口核酸内切酶识别的序列的寡核苷酸弓I物将由切口核酸内切酶识别的序列弓I入到模板核酸中。在某些实施方案中,包含由切口核酸内切酶识别的序列的弓丨物包含不与模板核酸杂交的5’标签序列,并且由切口核酸内切酶识别的序列处于所述标签序列中。这样的引物在本文中被称为“带标签引物”,图2中示意性示出了对应的实施方案。还可以采用诱变引物,S卩,与原始模板序列不是
100%互补的引物,由此引入合适的切口核酸内切酶的识别序列。本发明的HDA反应优选为嗜热的HDA(tHDA),即,所使用的酶在所述方法的温度下是热稳定的。热稳定的酶典型地为源自于热稳定的生物的酶。因此,优选地,在超过60°C、更优选在60°C和70°C之间、甚至更优选在60°C和65°C之间、最优选在约64°C至65°C的温度下执行本发明的方法。例如可以使用水浴、加热模块、温箱或热循环仪来维持温度。本发明的方法通常为等温方法,这意味着,该方法是在单个温度下执行的,而不像例如在PCR中那样需要温度循环。然而,在本发明的某些实施方案中,在恒定的实际反应温度下执行反应之前,可以包括在典型地超过90°C、优选约95°C的高温下的热变性步骤。于是,与在单个温度下执行的“一步法”方案不同,这被称为“两步法”反应。在某些情况下,两步法方案可以产生更高的灵敏度。因此,在本发明的情形下,两步法方案是优选的。事实上,在本发明的切口HDA方法中,在解旋酶、聚合酶、切口酶以及合适的正向和反向寡核苷酸引物存在下温育模板核酸。另外,需要存在用于扩增反应的其它试剂,例如dNTP、ATP或dATP以及镁离子。反应混合物优选地还包含缓冲剂和盐例如NaCl和/KCl。各个酶和试剂可以在开始扩增之前被一起加入或者可以被顺次加入。在某些具体实施方案中,在其它组分之后加入切口核酸内切酶。在两步法方案的优选实施方案中,在初始的热变性步骤之后加入酶。术语
“引物”是指能够与靶核酸上的单链区结合以促进靶核酸的聚合酶依赖性复制的单链核酸。在本发明的情形下,向模板核酸添加一个或多个引物。使用一个引物引起线性扩增,而使用两个或甚至更多个引物引起指数扩增。术语“解旋酶”在本文中是指能够将双链核酸酶促解旋的任何酶。例如,解旋酶是可见于所有生物以及所有涉及核酸的过程例如复制、重组、修复、转录、翻译和RNA剪接的酶。(Kornberg和Baker,《DNA复制》(DNAReplication),(第2版(1992)),特别是第11章)。任何沿着DNA或RNA以5’至3’方向或以相反的3’至5’方向易位的解旋酶均可用于本发明的实施方案。这包括从原核生物、病毒、古生菌和真核生物获得的解旋酶或天然存在的酶的重组形式,以及具有指定的活性的类似物或衍生物。由Kornberg和Baker在他们的书《DNA复制》,(第2版(1992))的第11章中描述的天然存在的DNA解旋酶的实例包括大肠杆菌()解旋酶1、I1、III和IV,Rep,DnaB,PriA,PcrA,T4Gp41解旋酶,T4Dda解旋酶,T7Gp4解旋酶,SV40大T抗原,酵母RAD。可用于HDA的其它解旋酶包括RecQ解旋酶(Harmon和Kowalczykowski,,:232-243(2001))、来自于腾冲嗜热菌()和极端嗜热菌()的热稳定的
UvrD解旋酶(Collins和McCarthy,:35-41.(2003))、来自于水生嗜热菌()的热稳定的DnaB解旋酶(Kaplan和Steitz,:6889-6897(1999))、以及来自于古生菌和真核生物的MCM解旋酶(Grainge等,:4888-4898(2003))。通常以5’至3’方向复制的解旋酶的实例是T7Gp4解旋酶、DnaB解旋酶和Rho解旋酶,而以3’-5’方向复制的解旋酶的实例包括UvrD解旋酶、PcrA、Rep、HCV的NS3RNA解旋酶。解旋酶可能需要辅因子,即,解旋酶的解旋活性所需要的小分子剂。解旋酶的辅因子包括三磷酸核苷(NTP)和脱氧核苷三磷酸(dNTP浓度)和镁(或其它二价阳离子)。例如,-1OOmM范围内、优选在1-1OmM范围内(例如3mM)的ATP(三磷酸腺苷)可以用作UvrD解旋酶的辅因子。类似地,在1-1OmM范围内(例如3mM)的dTTP(脱氧胸苷三磷酸)可以用作T7Gp4B解旋酶的辅因子。在本发明的某些实施方案中,特别是对于非嗜热的HDA来说,反应中可以存在其它蛋白例如拓扑异构酶或辅助蛋白例如单链DNA结合蛋白(SSB),以便促进解旋酶活性。在单链结合蛋白(SSB)存在下,解旋酶显示出改进的活性。在这些情况下,SSB的选择通常不限于特定的蛋白。单链结合蛋白的实例是T4基因32蛋白、大肠杆菌SSB、、噬菌体phi29SSB(Kornberg和Baker,同上(1992))和前述蛋白的截短形式。在使用热稳定的解旋酶的情况下,一种或多种