人非小细胞肺癌中的易位和突变的ros激酶的制作方法.docx

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专利名称:人非小细胞肺癌中的易位和突变的ros激酶的制作方法
技术领域:
本申请基本上涉及癌症中涉及的蛋白质和基因,本申请还涉及癌症的检测、诊断和治疗。
背景技术:
许多癌症的特征在于导致细胞过程控制异常或者导致细胞生长和增殖失控的细胞信号途径的破坏。这些破坏经常是由于特定的信号蛋白如激酶的活性改变引起的。这些癌症中之一是非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC是美国癌症患者死亡的首要原因,并且约占所有肺癌的大约87°/。。在美国每年新增加约151,000名NSCLC患者,据估计仅美国每年因该病死亡的患者超过120,000人。见"CancerFactsandFigures2005,"AmericanCancerSociety。NSCLC包括三种不同的亚型,通常在转移后才能被检测到,因此诊断后的两年内的死亡率为75%。
已知导致激酶融合蛋白异常信号活性的基因易位可以直接导致某些癌症。例如,己直接证实BCR-ABL癌蛋白,一种酪氨酸激酶融合蛋白,是人慢性髓性白血病(CML)的致病因子。据发现在至少90-95%的CM病例中LBCR-ABL癌蛋白是通过9号染色体上的c-ABL蛋白酪氨酸激酶的基因序列易位到
22号染色体的BCR序列上产生的,产生所谓的Philadelphia染色体。:990-998(1988)。在急性淋巴性白血病和AML病例中都能发现易位。
已经描述了导致突变或融合蛋白的基因易位也出现在许多其它的癌症中。例如,Falini等,Blood99(2):409-426(2002),概括了已知出现在血癌中的易位。到目前为止,仅描述了小量的存在于肺癌中的基因易位和突变的蛋白,包括涉及Notch3的t(15;19)的易位。参考Dang等,.
692(16):1355-1357(2000)。在小细胞肺癌和非小细胞肺癌中都发现RNA结合蛋白-6(RBM-6)表达和/或活性缺陷。参考Drabkin等,Oncogene8(16):2589-97(1999)。然而,到目前为止,还没有描述在人NSCLC癌症中涉及蛋白激酶的易位。
在人的卵巢癌中己经发现SLC34A2表达和/或活性缺陷。参见Rangel等,Oncogene22(46):7225-7232(2003)。同样地,已描述了在成胶质细胞瘤中由于FIG-ROSdd(6)(q21,q21)易位导致的ROS激酶表达缺陷。参见Charest等,(1):58-71(2003)。还描述了能够在小鼠中驱动肿瘤生长的ROS激酶的截短形式。参见Birchmeier等,(9):3109-3115(1986)。到目前为止,在
ROS激酶中还没有己知的激活点突变。
鉴定人癌症中的易位和突变是非常需要的,因为这可以开发靶向所述融合或突变蛋白的新的治疗剂和鉴定具有所述基因易位的患者的新的诊断剂。例如,BCR-ABL已经成为用于开发治疗白血病的治疗剂的靶。最近,Gleevec(Imatinibmesylate,STI-571),—种ABL激酶的小分子抑制剂,已经被批准用于治疗CML。这种药是最先设计干扰促进癌细胞生长的信号途径的新的抗增殖药。这种药物的发展表现出比传统用于CML和ALL的治疗方法、化疗和放疗显著的进步,传统用于CML和ALL的治疗方法、化疗和放疗由于熟知的副作用令人苦恼,并由于它们不能特异性靶向导致恶性肿瘤的根本原因从而经常导致有限的效果。同样地,为了鉴定患者最可能应答的靶向抑制剂如Gleevec,已经描述了特异性检测患者中BCR-ABL融合蛋白的试剂和方法。
因此,还需要鉴定在人癌症包括肺癌如NSCLC发展中导致融合或突变蛋白的新的基因易位,和需要发展用于研究和检测所述融合蛋白的新的试剂和方法。鉴定所述融合蛋白能够使选择用于靶向治疗的患者以及筛选抑制所述突变/融合蛋白的新药的新方法成为可能。
发明简述
根据本发明,在人非小细胞肺癌(NSCLC)中已经鉴定出新基因易位(4pl5,6q22),该易位导致了组合了钠依赖性磷酸盐转运蛋白同工型
NaPi-3b蛋白(SLC34A2)的部分和原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前体(ROS)激酶的融合蛋白。估计这两种SLC34A2-ROS融合蛋白保留了ROS酪氨酸激酶活性并驱动表达所述融合蛋白的癌症亚型中NSCLC的增殖和存活。
因此,本发明部分提供了分离的多核苷酸和编码公开的突变ROS多肽的载体、检测它们的探针和方法、分离的突变ROS多肽、重组突变多肽、和检测突变ROS多核苷酸和多肽的试剂。公开的鉴定新的突变ROS激酶蛋白和SLC34A2易位使检测在生物样品中存在突变ROS多核苷酸或者多肽的新方法成为可能,使筛选抑制突变激酶蛋白的方法成为可能,以及使抑制以表达突变ROS多核苷酸或者多肽为特征的癌症的发展的方法成为可能,所述突变ROS多核苷酸或者多肽也由本发明提供。本发明的各个方面和实施方案将在下文更详细地描述。
图1分别表示SLC34A2基因和ROS基因在染色体4p和6q的位置(A组),全长SLC34A2和ROS蛋白的结构域位置以及两个SLC34A2-ROS融合蛋白变体的结构域位置(组B和组C)。在第一个变体(长的)中,融合接头(fosionjunction)位于ROS的跨膜结构域上游的第1750个残基处,而在第二个变体(短的)中,接头位于第1853个残基处。
图2A是人SLC34A2-ROS融合蛋白第一个变体(长的)的氨基酸序列(一个字母编码)(SEQIDNO:1)(上组),并指出了编码
DNA序列(SEQIDNO:2)(下组);SLC34A2部分的残基为斜体,而ROS的激酶结构域的残基为粗体。
图2B是人SLC34A2-ROS融合蛋白第二个变体(短的)的氨基酸序列(一个字母编码)(SEQIDNO:3)(上组),并指出了编码DNA序列(SEQIDNO:4)(下组);SLC34A2部分的残基为斜体,而ROS的激酶结构域的残基为粗体。
图3是人SLC34A2蛋白的氨基酸序列(一个字母编码)(SEQIDNO:5)(SwissProt登录号为095436X上组),并指出了编码DNA序列(SEQIDNO:6)(GeneBank登录号NM—006424)(下组);下划线部分是易位的残基。图4A是人ROS激酶的氨基酸序列(一个字母编码)()(SwissProt登录号P08922);下划线的是第一个变体(长的)易位涉及的残基,而下划线粗体的为第二个变体(短的)易位涉及的残基。图4B是人ROS激酶的编码DNA序列(SEQIDNO:8)(GeneBank登录号NM—002944);下划线的是第一个变体(长的)易位涉及的残基,而下划线粗体的残基为第二个变体(短的)易位涉及的残基。
图5是人NSCLC细胞系(HCC78)提取物的蛋白质印迹分析,该图表示了具有比全长/野生型ROS低很多的分子量的ROS型的表达。
图6是通过5'RACE产物用ROS引物经历2轮PCR后检测ROS的凝胶图;给出了所使用的引物(SEQIDNO:13-15)。
图7是通过RT-PCR检测由SLC34A2和ROS易位形成的融合基因的凝胶图;给出了两种变体(长的和短的)各自的外显子4/外显子32融合接头的蛋白(和DNA)序列(SEQIDNO:9和SEQIDNO:10)和外显子4/外显子34融合接头的蛋白(和DNA)序列(SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12)。
图8是表示SLC34A2基因中外显子1-4和ROS基因中的外显子32-34的位置,这些外显子参与了形成融合蛋白的易位;箭头指出了用于PCR扩增所述融合蛋白变体的引物位置,并且给出了引物序列(SEQIDNO:17-20)。
图9是表示SLC34A2-ROS融合蛋白(长(短)变体)在转染的293细胞(人胚胎肾细胞)中表达的凝胶图,并与对照作比较(泳道1和2)。
图10表示在人NSCLC细胞系中siRNA对突变ROS激酶的抑制作用A组表示在转染siRNA后细胞抑制图,B组表示ROS的特异性敲低(knock-down)和增加凋亡(在突变ROS驱动的细胞系中)的免疫印迹,C组是表示ROS下游的信号分子活性降低的免疫印迹。
图11是使用双色断裂-分离探针(2-colorbreak-a-partprobe)通过FISH特异性检测SLC34A2-ROS融合/易位(在人NSCLC细胞系中)的图像。
发明详述
根据本发明,以前已知的能导致突变激酶融合蛋白SLC34A2-ROS
的基因易位已在人非小细胞肺癌(NSCLC)中被鉴定,非小细胞肺癌是肺癌的亚型。发生在染色体(4pl5)和染色体(6q22)之间的易位产生了两个融合蛋白变体,该融合蛋白变体组合了钠依赖性磷酸盐转运蛋白同工型NaPi-3b蛋白(SLC34A2)的N端和原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前体(ROS)激酶的跨膜和激酶结构域,其中所述钠依赖性磷酸盐转运蛋白同工型NaPi-3b蛋白是具有690个氨基酸的磷酸盐转运蛋白,所述原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前体激酶是具有2347个氨基酸的受体酪氨酸激酶。得到的SLC34A2-ROS融合蛋白分别具有724个氨基酸(长的变体)和621个氨基酸(短的变体),估计这两种SLC34A2-ROS融合蛋白保留了激酶活性并驱动表达所述融合蛋白的人NSCLC肿瘤亚型的增殖和存活。
尽管一些导致涉及ROS激酶的异常融合蛋白的基因易位己被描述,包括在成胶质细胞瘤中FIG-ROSdd(6)(q21,q21)的易位(参见Charest"(2003),同上.)和ROS的截短的活性型式(参见Birchmeier"al.,同上.),最近公开的SLC34A2-ROS易位和融合蛋白是新的,该融合激酶是第一次被报道存在人NSCLC。SLC34A2是磷酸盐转运蛋白,在人肺和小肠中表达,其具有钠依赖活性。在卵巢癌中已发现SLC34A2表达和/或活性缺陷。参见Rangel等,同上。ROS是跨膜受体酪氨酸激酶,属于胰岛素受体亚家族(subfamily),参与了细胞增殖和分化过程。
ROS在人、各种不同组织的上皮细胞中表达。在成胶质细胞瘤和中枢神经系统的肿瘤中己发现ROS表达禾口/或活性缺陷。参见如Charest等(2003),同上。
如下文进一步的描述,目前已分离和测序了SLC34A2-ROS易位基因和融合蛋白,并已经制备了表达突变激酶蛋白的cDNA。因此,本发明一部分提供了编码SLC34A2-ROS融合多肽的分离多核苷酸,能与所述多核苷酸杂交的核酸探针,以及使用所述多核苷酸制备重组突变ROS多肽的方法、载体和宿主细胞。本发明另一部分还提供了包括编码SLC34A2-ROS融合多肽的氨基酸序列的分离的多肽、重组突变多肽和能特异结合和/或检测SLC34A2-ROS融合多肽但不结合或者检测野生型SLC34A2或野生型ROS的分离的试剂。本发明的这些方面将在下文进一步详细地描述,这些方面对于进一步研究由突变ROS激酶表达/或活性所驱动的癌症机制以鉴定肺癌和以SLC34A2-ROS易位和/或融合蛋白为特征的其它癌症特别有用,在下文中还将进一步描述本发明的实施方法。
鉴定新的ROS激酶突变体和易位对于有效地诊断和治疗以易位和/或融合蛋白为特征的疾病如NSCLC具有非常重要的意义。NSCLC是美国癌症患者死亡的主要原因,NSCLC难以诊断,经常在转移后才能被诊断,从而增加了有效治疗和治愈该疾病的难度。因此,NSCLC在诊断后两年内的死亡率为
75%。参见AmericanCancerSociety,同上。尽管目前耙向EGFR-抑制剂己被批准用于治疗NSCLC,但是据估计这种治疗对于患有表达突变ROS激酶(不是或者除EGFR外)并受该激酶部分或全部驱动的肿瘤的患者可能部分或完全无效。
因此,在NSCLC中由于基因易位导致形成、预期能驱动NSCLC肿瘤亚型的增殖和存活的SLC34A2-ROS融合蛋白的发现使准确鉴定哺乳动物肺癌(如NSCLC)以及表达SLC34A2-ROS融合蛋白或截短的ROS激酶的其它癌症的重要新方法成为可能。这些肿瘤很可能对突变ROS激酶的激酶活性的抑制剂起反应。尽可能早地鉴定受突变ROS激酶驱动的癌症的能力将有力地支持在临床上确定哪种治疗剂或者组合哪些治疗剂对于特定患者是最合适的,从而有助于避免开出靶向其他激酶的抑制剂的处方,而所述其他激酶事实上不是驱动该癌症的主要信号分子。
因此,本发明部分地提供了采用本发明的融合特异性和突变特异性试剂检测癌症中存在的SLC34A2-ROS易位(t(4,6)(p15,q22))和/或融合多肽的方法。这种方法可以被用于例如鉴定癌症如NSCLC肿瘤,这种肿瘤可能对突变蛋白的ROS激酶活性的抑制剂起反应。本发明还部分地提供了确定一种化合物是否能抑制以SLC34A2-ROS融合多肽为特征的癌症的发展的方法。本发明还提供了通过抑制突变多肽的表达和/或活性抑制表达SLC34A2-ROS融合多肽的癌症的发展的方法。这些方法详细描述如下。
在下文中将更详细地描述本发明的其它方面、优点和实施方案。所有引用的参考文献以全文并入本文参考。
定义
"抗体"是指所有类型的免疫球蛋白,包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE,包括其Fab或抗原识别片段,包括嵌合、多克隆和单克隆抗体。本文所使用的术语"人源化抗体"是指为了与人抗体更相似在非抗原结合区的氨基酸被取代但保留了原有结合能力的抗体分子。
术语"生物活性"是指具有天然存在分子的结构、调节或者生物化学功能的蛋白质。同样,"免疫学活性"是指天然、重组或合成的SLC34A2-ROS融合多肽或截短的ROS多肽、或者其任何寡肽能够在适当的动物或细胞中诱导特异性免疫反应并结合特异抗体的能力。
术语"生物样品"采用其最广泛的意义,意指被怀疑含有SLC34A2-ROS融合体或截短的ROS多核苷酸或多肽或其片段的生物样品,可以包括细胞、从细胞中分离的染色体(例如,伸展的中期染色体)、基因组DNA(在溶液中或结合到固体支持物上如用于Southern分析)、RNA(在溶液中或结合到固体支持物上如用于northern分析)、cDNA(在溶液中或结合到固体支持物上)、细胞提取物、血液、尿、骨髓或组织等。
涉及癌症和突变ROS多核苷酸或者多肽使用的"以、、、为特征