基于PCR技术的100bpDNAladder制备用模板p111及其制备体系的制作方法.docx

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专利名称:基于PCR技术的100bpDNAladder制备用模板p111及其制备体系的制作方法
技术领域:
本发明设计属于分子生物学和基因工程研究领域中电泳耗材DNAmarkeH脱氧核糖核酸分子量标准)的制备方法的革新。具体地说,本发明以一种专有的PCR模板设计,建立了一种全新的基于PCR技术的制备IOObpDNAladder的新模式。
背景技术:
DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA分子的混合物,电泳后按照其分子量的大小和迁移率的不同,在凝胶上形成一个由DN***段大小决定的分布梯度,用以指示电泳过程实验DNA样品的分子量。目前,DNA分子量标准多是购自生物公司;同时由于其应用的普遍性和必要性,为了节约开支,很多实验室都自己制备常用的分子量标准。按照DNA分子量标准制备所涉及的关键技术(过程),其制备方法可以分为限制性内切酶酶切和PCR扩增两种方法;其中限制性内切酶酶切的DNA分子的来源又可以分为天然的基因组DNA和人工构建的质粒载体;PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增。
DNA分子中存在的限制性内切酶酶切位点(天然的或人为加入的),采用合适的内切酶对其进行消化,从而形成一组分子量各异的DN***段,用来作为DNA分子量标准。按照被消化DNA的来源可以分为两种天然来源的特种DNA(如基因组)和人工构建的质粒DNA。天然来源的基因组DNA的限制性内切酶酶切是通过分离某种来源的基因组DNA分子,然后用一种或几种限制性内切酶进行消化,从而产生一系列的DN***段组合,目前最常见的此类DNA分子是Lamda噬菌体的基因组DNAUDNA),由其产生的DNA分子量标准有XDNA/Hindlll,λDNA/EcoRI+HindIII等,也可以是某种具有多个常见酶切位点质粒,如pBR322DNA/AluImarker和pBR322DNA/BsuRI(HaeIII)marker,但是所用的内切酶都是不常用的,因而成本较高。人工构建载体(质粒)的限制性内切酶酶切是通过一次性把所需要的各种DN***段克隆到高拷贝数的载体上,转入大肠杆菌,通过发酵培养和质粒DNA的分离纯化,经过适当的酶切即可以获得大量的目标DN***段。这种方法的优势在于通过大肠杆菌的发酵扩增质粒获得目的DN***段,其制备规模很容易放大,获得的DN***段片段在凝胶上片段锐利,过程重复性好。但这种制备方法也存在明显的缺点构建含有多DN***段的重组载体技术要求较高,技术水平直接决定了所构建载体产生的DNA分子量标准的质量。同时这种载体酶切的制备方式也不适用于DNA小片段的制备,目前
DNA小片段主要是通过PCR扩增的方式进行制备。(PolymeraseChainReaction)技术强大的DN***段的扩增能力,同时由于目前TaqDNA聚合酶工程菌株的广为流传,目前利用PCR方法生产DNA分子量标准不存在技术问题,成本主要是引物合成和购买dNTP的成本,其他PCR试剂如TaqDNA聚合酶,模板DNA,反应Buffer等均可自制。由于生产效率低,劳动强度高,因而限制了其大规模的制备和应用。由于上述的PCR技术制备DNA分子量标准的缺陷,很多人都尝试采用新的PCR设计以提高PCR技术制备DNA分子量标准的效率,但是技术水平改观不大。长期以来,分子生物学试剂与基因工程研究领域缺少作为PCR模板用的复合重组载体设计方案和一种用于IOObpDNAladder中片段扩增的专用载体,以及与之相应的制备体系。利用本发明中的载体可以复合体的方式制备DNA小片段,然后通过PCR产物的酶切得到所需的目标DNA小片段;以克服普通PCR扩增产生DN***段生产效率低,劳动强度高等缺陷;从而能够快速、大规模的地生产DNA分子量标准IOObpladder。
发明内容
鉴于此,我们设计和构建了用作PCR扩增模板的重组载体plll,并建立了相应的IOObpDNAladder的制备体系,恰恰满足了上述需求,其目的在于提供了一种IOObpDNAladder
类型DNA分子量标准小片段PCR扩增的重组载体pill。本发明的进一步目的在于提供一种利用上述重组载体通过PCR扩增和酶切相结合的方法制备IOObpDNAladder中所需的DNA分子的制备体系。为了实现上述目的,本发明提供的重组载体pill是一种专门用于IOObpDNAladder制备用的PCR重组载体;其图谱中含有3个IOObp的重组DN***段,每个IOObp片段两端均有两个EcoRI酶切位点,三条重组DN***段的结构为E100E100E100E。本发明中IOObpDNAladder的PCR扩增用重组载体pill的构建方法,包括如下步骤分别以拟南芥基因组的DNA为模板,利用PCR的方法扩增获得了如下片段100E、E100E、E100bp,其中IOObpE的3,末端、ElOObp的5,末端,E100E的两个末端带有EcoRI限制向内切酶的位点,三种DN***段经EcoRI酶切后,以一种顺序连接的方式进行连接,然后以末端引物(DN***段100E的正向引物+DN***段ElOO的反向引物)对连接产物进行扩增,筛选获得连接产物100-100-100bp。同时为其末端添加TA克隆中所需要的突出端A(腺嘌呤核苷酸);将上述连接产物TA克隆到克隆载体pGFM-Teasy中,即得到所需的模板pill。其IOObpDNAladder制备体系为以重组载体pi11为模板,在其核心序列(100-100-100bp)两侧选择合适位点作为引物序列,扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体100/200/300/400/500-丨100-100-100丨-100/200/300/400/500
,共25种复合体。经
EcoRI酶切后,上述的复合体可被分解为各种IOObpDNAladder中所需的DN***段(100、200、300、400、500bp)。本发明的有益效果在于设计了一种PCR扩增重组载体plll,其中含有3条由4个EcoRI酶切位点分隔的IOObp重组片段;以此重组载体为PCR扩增模板能够以复合体的形式高效制备IOObpladder中的DN***段(通过EcoRI酶切)。与传统的PCR扩增方法相比具有消耗少(如dNTP、DNA聚合酶、引物、反应缓冲液、耗材等)、效率高(多片段的同时扩增)、省时省力等优点;其优势还在于通过引物位点的选择可以灵活的调整所制备的DN***段的种类及其之间的数量关系。
图1是生产IOObpDNAladder用的重组载体pill图谱。具体实施实例参照附图,本发明提供的重组载体pill是一种专门用于IOObpDNAladder制备用的PCR扩增模板;其图谱中含有3个IOObp的重组DN***段,每个IOObp片段两端均有两个EcoRI酶切位点,三条重组DN***段的结构为E100E100E100E。其IOObpDNAladder制备体系为以重组载体pi11为模板,在其核心序列(100-100-100bp)两侧选择合适位点作为引物序列,扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体100/200/300/400/500-|l00-100-100|.-100/200/300/400/500,共25种复合体;经EcoRI酶切后,上述的复合体可被分解为各种IOObpDNAladder中所需的
DN***段(100、200、300、400、500bp)。
权利要求
基于PCR技术的100bpDNAladder重组载体p111,其特征在于其图谱中含有3个100bp的重组DN***段,每个100bp片段两端均有两个EcoRI酶切位点,三条重组DN***段的结构为E100E100E100E。
,在其核心序列(100-100-100bp)两侧选择合适位点作为引物序列,扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体100/200/300/400/500-「100-100-1001-100/200/300/400/500,共25种复合体;经EcoRI酶切后,上述的复合体可被分解为各种IOObpDNAladder中所需的DN***段(100、200、300、400、500bp)。
全文摘要
基于PCR技术的100bpDNAladder重组载体p111,图谱中含有3个100bp的重组DN***段,每个100bp片段两端均有两个EcoRI酶切位点,三条重组DN***段的结构为E100E100E100E。制备体系为以重组载体p111为模板,在其核心序列(100-100-100bp)两侧选择合适位点作为引物序列,扩增可以获得如下类型的PCR产物复合体100/200/300/400/500--100/200/300/400/500,共25种复合体;经
EcoRI酶切后,上述的复合体可被分解为各种100bpDNAladder中所需的DN***段。