含有EB病毒壳蛋白gp125基因工程菌株的建立及其应用的制作方法.docx

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专利名称:含有EB病毒壳蛋白gp125基因工程菌株的建立及其应用的制作方法
EB病毒(Epstein-BarrVirus)是一种对人致病的病毒,可以引起传染性单核细胞增多症、鼻咽癌和多种淋巴病,其中鼻咽癌在我国南方数省具有较高的发病率,在各种恶性肿瘤中占第一位。在EB病毒感染的人和鼻咽癌患者血清中存在一种抗体,这种抗体是特异性地针对EB病毒感染和是否患鼻咽癌(NPC)。在NPC高发区,进行人群普查,甚至可以在发病前数年,检查出血清中的抗体。我国在EB病毒感染和NPC的血清诊断方面一直使用国内外从70年代沿用至今的检查抗体的方法。即将带EB病毒的肿瘤细胞涂在玻璃片上,涂片前,要用肿瘤激活因子激活细胞,增加细胞中病毒壳蛋白的含量,然后经***固定细胞,在细胞片上加上人血清,结合后,洗去未结合的血清,再加标记物,最后用显微镜检查细胞中是否有与抗原结合的血清抗体。该方法存在的缺陷是(1)自然产生EB病毒壳蛋白的细胞株,培养困难,而且肿瘤细胞及肿瘤病毒对环境和操作者是一种危害;(2)产生抗原的细胞仅占总细胞数的10%,而这些产生抗原的细胞中又仅有极低量的有效成分,直接影响检查方法的敏感性;(3)这种肿瘤细胞带有多种EB病毒特有的蛋白,人血清中也存在对不同蛋白的抗体,因此,影响了检查
EB病毒壳抗体的特异性;(4)检查方法繁琐,试想面对数万人普查和追踪数年,用显微镜逐个观察,人力、物力都是不可能的,因此限制了普查和追踪的范围。对一种检查方法好坏的评价,关键是敏感性,特异性和简便程度。
EB病毒基因组(genome)的DNA序列于1984年发表(Bear,-8Epstein-(Landon)310207-211,1984)。1985年Pearson等人首先证明EB病毒壳蛋白能用于检查传染性单核细胞增多症病人血清中抗体,并且用于鼻咽癌的诊断(;--199,Plenumpress,NewYork,1985)。产生壳蛋白的基因称BALF4,即病毒全基因组经内切酶BamHI切割后,在最大的一片***段中,向左转录的第四个开放读码序列所表达的蛋白。壳蛋白gp125是病毒感染后的主要免疫源,经分离纯化的gp125用于疾病的诊断。Luke等人从自然产生EB病毒的肿瘤细胞株,B95-8细胞中提取了gp125,作为抗原,用于诊断,并与B95-8细胞涂片方法比较,证明了用纯化的gp125检查抗体,更为敏感和特异。相继,在国外的一些报道中均提出了这样一个方向,必须用基因工程方法,大量表达gp125,为EB病毒感染和鼻咽癌的诊断提供有效的切实可行的手段,即敏感性强,特异性好,简便易操作和经济实惠。而从
B95-8细胞中获gp125,方法繁琐,昂贵,而且自然表达量低,不可能获得可应用的量,纯化方法及大量细胞培养带来的困难和不安全因素无法克服,只能是实验室中的探索,但为基因工程方法表达gp125抗原提供了很好的依据(,1988,Dolken,G等人,,1984,Uen,w-,1988)。随着分子生物学技术的发展,用基因工程手段表达某种特定的,单一的成分用于诊断是当今世界上诊断领域的重要进展,特别是对尚不能人工培养的病毒,必须用基因工程抗原作为诊断。
本发明的目的在于建立一种含有EB病毒壳蛋白gp125基因的工程菌株,和用此工程菌表达的EB病毒壳蛋白作为诊断抗原用于疾病的诊断。
本发明是从分离gp125基因开始,相继在原核和真核系统中表达这段基因,证明了其表达产物的特点,即与天然的gp125相似的免疫反应,并且建立了能用于实际应用的诊断方法。
BALF4基因近3000碱基对(bp),在构建全基因的同时,首先用大肠杆菌表达了BALF4的部分序列,以证明其产物的可使用性,然后再将全基因分别以痘苗病毒、昆虫杆状病毒为载体在真核细胞中表达全部BALF4基因。昆虫杆状病毒是近几年发展起来的新的载体,表达量高于痘苗病毒载体,因此在用痘苗病毒为
载体表达的基础上,又以昆虫杆状病毒为载体,在昆虫细胞中更高效表达gp125,为实际应用提供更大量的抗原。
一、***全长11000多个碱基对,它被克隆在质粒pBR322中,其克隆过程如下用内切酶BamHI/EcoRI从***中获得5200bp一段DNA,含gp125全部基因,利用这段DNA上的两个XhoI酶位点和两点之间的pst-1酶,获得约1000bpXhoI/pst-1区段,含gp125全基因中段的三分之一以上序列。
将上述基因插入puc载体,puc系统是大肠杆菌质粒,能在大肠杆菌中独立复制,其中的启动子能使其下游插入的三联密码相匹配的外来DNA编码相应的蛋白。(puc载体系统有puc8,12,13,18和19,可以从任何一家生物工程公司购得,是世界通用载体),将分离得到的XhoI/pst-1基因插入puc载体启动子下游的HincII/pst-1位点,即用HincII/pst-1酶将环状的puc质粒DNA切成直线状,再用T4DNA连接酶将XhoI/pst-1DNA连接在质粒DNA的切口上,使成重组的环状DNA,将其转染进入经***化钙处理过的大肠杆菌。在选择培养基上能存活的细菌即含重组的DNA。
分析其DNA特征和检查表达产物用内切酶分析重组的质粒DNA,与原始puc比较,它含有插入的目的DNA;用蛋白质凝胶电泳证明其表达产物的存在及特征。获得的细菌株,低温保存,需要时可以扩增至想要的体积。
,单个菌落在5mlLB培养液中摇过夜,次日放大至100ml,37℃摇3-4小时,1mMIPTG诱导3小时,5000rpm收集细菌菌体(以上为常规细菌培养,任何工程菌均用此方法培养),%Tritonx100裂解液悬成悬液,超声波处理,高速离心(10000rpm)获包函体沉淀,经4M脲清洗,再溶解包函体于8M脲,进一步用DEAE-SepharoseFF(Pharmacia产品)***化钠梯度纯化,获活性蛋白峰。
纯化的蛋白作为诊断抗原,用于ELISA检查人血清中的抗体,从100ml工程菌中能获得20ml纯化的蛋白,可供一万人份血清检测。
二、以痘苗病毒为载体表达gp125全基因痘苗病毒是作为疫苗用来预防天花,其基因组能容纳外来的基因而不改变其病毒在细胞内的复制,用痘苗病毒作为载体携带gp125基因,当重组的痘苗病毒在细胞中复制时,即产生了gp125蛋白。
,它能在大肠杆菌中独立复制,又能把目的基因带到痘苗病毒中去,形成重组的痘苗病毒。此过程在细胞内完成。转移载体包括(1)能在细菌中独立复制的区段;(2)痘苗病毒的启动子及启动子下游的接头,供外源目的基因插入;(3)痘苗病毒的一段序列分成两段分别存在于启动子和克隆位点的左右两侧,形成框架
(flank);(4)分离gp125基因,插入痘苗病毒启动子下游。(,1984)从PGS20分离一个EcoRI片段DNA,插入PJ11质粒,在PJ11中含痘苗病毒核酸的一段非必须区,。BALF4基因的分离利用ATG前方6bp处的MnLI酶位点,首先分离200bp一段DNA,插入puc质粒HincII位点,再利用此片段中的单一MLuI酶位点及puc上的HindIII位点,克隆其余的BALF4基因序列,并使BALF4基因两侧各有一个BamHI位点,,启动此基因的启动子及重组入痘苗病毒核酸的一段同源序列。
,子代病毒的核酸中含有gp125基因,即重组的病毒具有了新的生物学性状,在细胞中表达gp125蛋白。其主要过程是细胞用痘苗病毒感染,在病毒核酸复制期,将转移载体DNA转染进入细胞。经核酸杂交方法或以胸腺嘧啶激酶作为选择标志,从正常的痘苗病毒子代中选出重组的病毒。
,在胞浆内产生大量的gp125。
(1)直接涂片这种细胞代替B95-8细胞涂片,检查人血清抗体;
(2)纯化抗原,用于ELISA,重组病毒感染的细胞,经低渗液膨胀,超声波裂解,高速离心的上清液再经DEAE-Sepharoseff纯化。
三、以昆虫杆状病毒为载体表达gp125全基因杆状病毒是目前国内外最高效的表达载体,表达产物占总蛋白量的30%,同时具真核系统的优点-蛋白质转录加工及免疫源性与天然蛋白相似。
我们将BALF4基因(含BamHI接头)直接插入昆虫杆状病毒载体pVL941,它是国际上通用载体,含昆虫杆状病毒多角体蛋白启动子及多角体蛋白基因,作为同源重组序列。构建成转移载体pVL941/BALF4。用此质粒DNA与昆虫杆状病毒DNA共转染昆虫细胞sf9。从子代病毒中筛选出表达核多角体蛋白阴性的病毒,经确定重组病毒的特点及表达产物的检查。
产物的纯化方法及应用同痘苗病毒载体。
综上所述,,其产物是非糖化的多肽,经纯化作为抗原检查血清抗体具有很好的反应性;,分别在真核细胞及昆虫细胞中表达gp125;(1)两种重组病毒感染的细胞涂片,代替目前使用的B95-8细胞涂片,作为人血清抗体的检查,由于抗原表达量大,单一,从而提高了敏感性和特异性。(2)从两种病毒分别感染的细胞中纯化抗原,用于包被ELISA板,建立了更敏感,特异,简便的方法,同时也经济,特别适用于大规模现场普查应用。
本发明不仅建立了含有EB病毒壳蛋白基因gp125的工程菌株,并用此工程菌株表达EB病毒壳蛋白基因,而且也建立了使用这种蛋白检查血清中抗体的方法,即ELISA和改进的金标记检查方法。
ELISA是将纯化的抗原吸附在塑料板孔中,已经广泛地用于乙型肝炎,丙型肝炎及艾滋病的检查。用ELISA检查EB病毒壳蛋白的抗体,是用基因工程表达的蛋白结合于塑料板孔中,直接使用或包装后供应市场。使用时,使用者只需将待检血清加入板孔中,37℃孵育30分钟,洗去血清,加金或酶标记抗体,37℃再孵育30分钟,然后加酶底物显色或直接以红色的金颗粒判定结果。
本发明在检测人群血清抗体上的初步应用实例如下一、以***固定的重组痘苗病毒感染的细胞(RV-C)为靶细胞以原始痘苗病毒感染的细胞(TV-C)及B95-8分别为阴性和阳性对照,用免疫荧光方法检查血清中EB病毒VCA/IgG、VCA/IgA抗体,确定表达产物的特异性和相关性,表1列出了检查儿童血清中VCA/IgG抗体的结果,59例年龄在3-12岁儿童血清VCA抗体阳性率为78%,以RV-C为靶细胞,GMT明显高于B95-8细胞。抗体滴度大于1∶80分别为35%和20%,但抗体滴度分布基本平行。RV-C为靶细胞,感染细胞中含有大量的VCA多肽,检查血清抗体,确定EB病毒原发感染及抗体水平较
B95-8细胞更敏感。
表1儿童血清中VCA/IgG抗体
二、检查了29例鼻咽癌(NPC)病人血清及30例北京血站正常人血清中VCA/IgA抗体,,30例正常人血清对不同靶细胞VCA/IgA抗体滴度均小于1∶10,以RV-C和B95-8细胞为靶细胞平行检查29例NPC病人血清中VCA/IgA抗体,抗体阳性率相同,。用重组痘苗病毒感染细胞为靶细胞特异性地检查VCA/IgA抗体,并且较B95-8细胞更为敏感,见表2。
表2NPV病人血清VCA/IgA抗体
三、进一步检查了NPC高发区正常人血清中VCA/IgA抗体,现场血清流行病检查的血清冰冻保存了六年,选其中用免疫酶方法在B95-8细胞片上检查VCA/IgA抗体阳性者67例,阴性血清50例;用免疫荧光方法以RV-C和B95-8细胞为靶细胞,平行检查VCA/IgA阳性率分别为79%和68%。抗体滴度分布基本平行,,见表3。对痘苗病毒抗体滴度均小于10,50例免疫酶法检查的阴性血清对不同靶细胞VCA/IgA抗体均为阴性。
表3儿童血清中VCA/IgG抗体
四、结合ELISA方法检查人血清中VCA/IgG及VCA/IgA抗体,经DEAE-Sepharoseff纯化的蛋白,包被ELISA板,分别检查血清中的VCA/IgG和VCA/IgA抗体,并以95-8细胞涂片,免疫荧光方法确定其敏感性和特异性。
100例正常人血清中,VCA/IgG抗体ELISA滴度均大于1∶200,1∶400-800之间占74%,GMT为517;100例来源于NPC高发区现场的血清,检查血清中VCA/IgA抗体,48例对B95-8细胞涂片阳性的血清中,1∶%。而ELISA检查,抗体滴度均大于1∶100,>1∶%;52例对B95-8细胞涂片阴性的血清中,在ELISA检查中,3例有低滴度抗体,进一步证明了本方法的敏感性。见表4和表5。表4检查人血清中VCA/IgG抗体
表5检查人血清中VCA/IgA抗体
本发明与目前国内外使用的间接免疫荧光和间接免疫酶方法比较,其优越性是更简便、敏感和特异。具体体现在以下方面1、简便,按每板100人份计算,一个人用半天时间可以做10-15板,即1000-5000人血清中的抗体,无需特殊训练,判定结果简单;2、敏感性和特异性,基因工程表达产物,由于高效表达,从质和量上解决了诊断抗原的来源,降低了成本,用纯化的抗原检查相关抗体,必然更特异;高效表达,为大规模使用提供抗原来源保证,同时也增加了检测的敏感性和稳定性。建立了ELISA检查EBV的VCA/IgG和VCA/IgA抗体,其敏感性提高100-1000倍;3、联合使用EB数种相关抗原,同时检查其不同的抗体,便于分析病程和愈后,而目前的涂片法不能显示不同的抗体;4、无需大量培养带肿瘤病毒的细胞及使用TPA激活细胞产生病毒,因此安全和没有对环境的污染。