兽医采样检测技术.pdf

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重大动物疫病采样监测技术
(适用于技能竞赛)
第一章畜禽血液和病料采集技术
第一节畜禽血液采集技术
一、要求:
1、所有采血用具均应事先以消毒、干燥处理;
2、采血部位要进行剪毛、清拭并按常规进行消毒(先碘酊后酒精)。
3、怀疑传染病时,采血过程要防止到处流散,检后的残余血液及所
用器皿要进行消毒处理。
4、需抗凝的要加入抗凝剂。常用的抗凝剂有:
①双草酸盐抗凝剂:
草酸钾

草酸铵

蒸馏水
加至100毫升:.
溶解后,,加入供采血用的试管或小瓶中,置干燥箱内
(温度不能超过80℃),烘干备用(实际含草酸盐10毫克,可供5
毫升全血抗凝用)
②枸橼酸钠6mg可使1ml血液不凝固,%的溶液。适用于
血钙的测定和血沉测定时的抗凝。
③乙二***四乙酸二钠(EDTA二钠)每10毫克可使5毫升全血抗凝;
或配成10%的溶液,每2滴可使5毫升全血抗凝。
④肝素对血中有机成分和无机成分测定均无影响,多用于科研。常用
肝素钠配成1ml内含1mg(%)的水溶液,
或小青霉素瓶中,在80℃以下烤干后备用,可使5~10ml血液不凝
固。
5、需分离血清的血液(不抗凝),试管要静置、斜放,便于血清晰
出。
6、注意安全。
二、牛静脉血液的采集
(一)颈静脉采血
1、器械:酒精、碘酊药棉;5ml或10ml试管,试管架;12~16#
针尖;毛剪、止血钳、镊子;3~4米细绳1根。:.
2、保定:站立保定。
3、助手:至少2人。
4、部位确定:一般在颈静脉沟的上1/3和中1/3交界处的颈静脉内
(两侧均可)。颈静脉沟位于颈下侧,由臂头肌和胸头肌形成的一肌
沟,外表肉眼可见。牛颈静脉位置如下图示:
5、操作:助手保定好牛头。先看(摸)清颈静脉沟,确定部位,局
部剪毛(看不清时)、消毒。以左手拇指(于左侧操作时)或中指和
无名指(于右侧操作时)按压颈静脉沟的中下部,或让助手用细绳横
勒颈中下部,稍等片刻,让颈静脉充分怒张,右手持针头在注射点按
静脉走向,与静脉呈45°角斜向迅速刺入。若牛皮较厚,指力有限,
用此法常感困难时,可手持针头,依靠腕力把针头朝静脉方向快速地
垂直刺入,当刺入静脉内,立见回血,即可用试管接之。若针头偏离
静脉(未见回血),可将针头稍稍退出或拔至皮下,在认清静脉走向
后重新刺入。一般来说,只要刺入静脉,针头内滴出之血液可有5~
10毫升,若滴出之血液量较少或较慢,可用手指按压颈静脉中下端
片刻即可。采血完毕,迅速拔出针头,用碘酊棉球按压针孔片刻即结
束。
(二)尾静脉采血
1、器械同上。:.
2、保定:站立保定。
3、部位确定:尾根腹侧中部。
4、操作:助手立于牛的右侧,将尾声轻轻抬起,使之基本与地面平
行,采血者立于牛的左侧,手持装有针头的注射器,使针头与尾椎纵
轴成45°角,向上向前方刺入约1~2cm,边刺边旋动注射器活塞,
见血即可。采血完毕,迅速拔出针头,局部按压、消毒。
三、猪静脉血液的采集
(一)耳静脉采血(适用于大猪)
1、器械准备:酒精、碘酊药棉;5ml或10ml试管,试管架;毛剪、
止血钳、镊子;配7#针尖的一次性注射器。
2、保定:左侧(或右侧)横卧保定。
3、部位确定:耳下缘1/2处。
4、操作:耳静脉局部常规消毒处理。助手用手指捏压耳根部静脉血
管,使静脉充盈、怒张。术者用左手的食指和中指在耳下将耳上托,
拇指在上部把注射点皮肤展平,右手持注射器把针头对准血管(针头
与血管成30~45°角)刺入,当初步判定针尖已刺入血管后,将注
射器放平,顺血管走向伸入(此时感觉针尖阻力明显减小),同时抽
动注射器活塞,慢慢抽取血液。如血管内血量较少,助手可用手指自:.
耳根向耳尖部挤抹。采血完毕,迅速拔出针头,局部用干燥棉球按压
止血。
(二)前腔静脉采血
1、器械准备:酒精、碘酊药棉;5ml或10ml试管,试管架;毛剪、
止血钳、镊子;配7#长针尖的一次性注射器。
2、保定:仰卧保定,两前肢与体中线垂直,两后肢后引,头部贴地,
使前腔静脉怒张。熟练时也可取半仰卧、侧卧或站立保定。
3、部位确定:刺入点右侧或左侧胸浅窝内,即在第一肋骨和胸骨柄
(胸骨的前端)结合处前方。亦有人刺入点定位于耳根与胸骨柄连线
上,胸骨柄前1~2指宽处。
4、操作:右手持针,针头斜向对侧或向后内方(与胸骨纵轴基本成
45°角),与地面成60°角,刺入2~5cm深(视猪只的大小定),
针头向刺入的同时,微微抽动活塞,使注射器形成负压,一旦进入前
腔静脉,立见血液涌入注射器。完毕后常规消毒。需要说明的是,刺
入点一般取右侧,因左侧靠近膈神经而易损伤。
四、家禽血样的采集
(一)鸡翅内侧静脉采血:.
1、器械准备:酒精棉球;小试管或细塑料管,试管架;镊子;配5~
7#针尖的一次性注射器。
2、保定:手提保定。助手一手抓住两只鸡腿,一手抓鸡翅根部,以
拇指按压静脉管。
3、部位确定:鸡翅内侧腋静脉,肉眼可见。
4、操作:助手抓住鸡翅根部,以拇指按压静脉管,使之充盈。术者
左手大拇指捏住鸡翅内侧,余四指捏住鸡翅外侧,展平鸡翅,右手持
针,沿血管方向,于血管傍先刺入皮下,然后再斜刺向血管,抽取血
液(此法避免拔针后出血过多)。也可直接刺向血管,抽取血液(采
用此法,拔针后要用干棉球按压数分钟止血)。或者将鸡翅摆平,直
接先将静脉用针刺破,待血液流出后,用细塑料管利用虹吸的原理吸
取血液,事毕,用火将细塑料管一头封闭。
(二)鸡心脏采血
方法1
操作要点:鸡左侧向上横卧保定,拔去胸上部部分羽毛,寻找由胸骨
走向肩胛的皮下大静脉,心脏约在该静脉的分支下侧,有时用食指可
摸到心脏跳动。用酒精消毒后,以碘酊标记部位。针头(7#)刺入
时,如触及胸骨可稍拔出,使针头稍向右偏,避开胸骨,再将针头向:.
里刺入,边刺边抽动活塞,若刺入心脏,便有血液涌入注射器,术毕,
局部消毒。
方法2
操作要点:鸡仰卧保定,鸡头部朝向术者,拔去胸上部少许羽毛,用
手指在胸骨上方、嗉囊下方摸得一凹窝,右手持针(7#),自胸骨
上方凹窝斜向前下方心脏方向(鸡的左侧、术者的右侧)刺入,边刺
边抽动活塞,若刺入心脏,便有血液涌入注射器,术毕,局部消毒。
注意:此法(含方法1、2)采血后,多会引起鸡只死亡,仅适用于
淘汰鸡的采血。
(三)鸡头部静脉窦采血
1、器械准备:酒精或碘酊棉球;小试管,试管架;镊子;配5-7#
短针尖的一次性注射器。
2、保定:助手一手抓鸡的两只腿,一手抓鸡的两翅,使头部向上。
术者左手食指和中指夹住鸡喙,大拇指压住颈上部,以此固定头部。
3、部位确定:鸡头后部,枕骨大孔为刺入点。
4、操作:鸡只如上述方法确切保定后,枕骨大孔部少许拔毛,消毒,
术者右手持针,自枕骨大孔进针,针头对准喙尖,约与颈椎纵轴成:.
45°角,~(视鸡只大小),刺入静脉窦后,针头
感觉无阻力,抽取血液,术毕消毒。
注意:此法采血后,亦会引起鸡只死亡,故适用于淘汰鸡的采血。苗
鸡采血亦可用此法。
五、羊静脉血样的采集
(一)颈静脉采血
1、器械准备:酒精或碘酊棉球;小试管,试管架;镊子;配7#长
针尖的一次性注射器。
2、保定:站立保定。保定需2人。一人立于羊的左侧前方,左手托
住羊的下颔,右手抱住羊的耳根部,使头上扬并贴住术者身体。另一
人产于羊的后方,用两手稳住羊的臀部,避免左右走动。
3、部位确定:同牛。一般在羊右侧颈中上部。
4、操作:术者蹲于羊的右侧,左手大拇指按压颈下部颈静脉的近心
端片刻,使颈静脉怒张,剪毛,酒精消毒后,以碘酊标记部位。右手
持针,针头与颈静脉成30~45°角,顺静脉方向刺入,抽取血液。
术毕,消毒按压止血。
(二)前腔静脉采血
方法基本与猪前腔静脉采血同。此法适用于羔羊。:.
第二节畜禽病料采集技术
一、样品采集的原则
采集检测样品是诊断检测工作的重要内容。采样的时机是否适宜,样
品是否具有代表性,样品处理、保存、运送是否合适及时,与检验结
果的准确性、可靠性关系极大。采集样品时,需要符合以下规定:
1、适时采样。根据检测要求及检测对象和检验项目的不同,选择适
当的采样时机十分重要。样品是有时间要求的,应严格按规定时间采
样,有临床症状需要作病原分离的,样品必须在病初的发热期或症状
典型时采样,病死的动物,应立即采样。
2、合理采样。根据诊断检测的要求,须严格按照规定采集各种足够
数量的样品外,不同疫病的需检样品各异,应按可能的疫病侧重采样。
对未能确定为何种疫病的,应全面采样。
3、典型采样。选取未经药物治疗、症状最典型或病变最明显的样品,
如有并发症,还应兼顾采样。
4、无菌采样。采集检验样品除供病理组织学检验外还供病原学及血
清学检验,供病原学及血清学检验的样品,必须无菌操作采样,采样
用具、容器均须无菌处理,尸体剖检需采集样品的,先采样后检查,
以免人为污染样品。:.
5、适量采样。采集样品的数量要满足诊断检测的需要,并留有余地,
以备必要时复检使用。
6、样品处理。采集的样品应一种样品一个容器,立即密封,根据样
品的性状检验要求的不同,作暂时的冷藏、冷冻或其它处理。供病毒
学检验的样品,数小时内要送到实验室,只作冷藏处理,超过数小时
的要冷冻处理,(冻结方法:可将样品放入-30℃冰箱内冻结,然后
再装入有大小冰块或干冰的冷藏瓶(箱)内运送,亦可将装入样品的
容器放入隔热保温瓶内,再放入冰块,然后按100g冰块加入食盐约
35克,立即将隔热保温瓶瓶口塞紧。瓶内温度可达-21℃左右)。供
细菌学检验或血清学检验的样品,冷藏送实验室即可。装样品的容器
应贴上标签,标签要防止因冻结而脱落,标签标明采集的时间、地点、
号码和样品名称,并附上发病、死亡等相关资料,尽快送实验室。
7、安全采样。既要保护采样人员,以要防止病原外泄,还要防止样
品受到污染。
8、样品包装。主要是密闭,防止样品损坏、污染和外泄等意外发生。
迅速送检。应尽快送实验室进行检测,延误送检时间,会影响到检测
质量和结果的可靠性。
二、血液样品的采集:.
1、病毒检验用血液样品。应在动物发病初体温升高期采集。血液样
品必须是脱纤血或是抗凝血。抗凝剂可选用肝素或EDTA,枸缘酸钠
对病毒有轻微毒性,一般不宜采用。采血前,在真空采血管或其它容
%肝素1ml或EDTA20mg。采集的血液立即
与抗凝剂充分混合,防止凝固。采脱纤血时,先在容器内加入适量小
玻璃珠,加入血液后,反复振荡,以便脱去血液纤维。采集的血液经
密封后贴上标签,以冷藏状态立即送实验室。必要时,可在血液中按
每毫升加入青霉素和链霉素各500~1000IU,以抑制血源性可采血中
污染的细菌。
2、细菌检验样品。采血应在动物发病初体温升高或发病期,未经药
物治疗期间采集。血液应脱纤或加肝素抗凝剂(或EDTA或枸缘酸钠),
但不可加入抗生素。采集的血液经密封后贴上标签,以冷藏状态立即
送实验室,否则须置4℃冰箱内暂时保存,但时间不宜过久,以免溶
血。
3、血清学检验样品。用作血清学检验的样品不加抗凝剂或脱纤处理。
为保障血清质量,一般情况下,空腹采血较好。采集的血液贴上标签,
室温静置待凝固后送实验室,并尽快将自然析出的血清或经离心分离
出的血清吸出,按需要分装,再贴上标签冷藏保存备检。较长时间才
检验的,应冻结保存,但不能反复冻融,否则抗体效价下降。作血清
学检验的血液,在采血、运送、分离血清过程中,应避免溶血,以免
影响检验结果。采集双份血清检测比较抗体效价变化的,第一份血清:.
采于发病的初期并作冻结保存,第二份血清采于第一份血清后3~4
周,双份血清同时送实验室。
4、寄生虫检验样品。因不同的血液寄生虫在血液中出现的时机及部
位各不相同,因此需要根据各种血液寄生虫病的特点,取相应时机及
部位的血液制成血涂片,送实验室。
三、组织样品的采集
组织样品一般由扑杀动物或病死尸体剖中采集。从尸体采样时,先剥
去动物胸腹部皮肤,以无菌器械将腹腔打开,根据检验目的和生前疫
病的初步诊断,无菌采集不同的组织。
1、病毒检验样品。作病毒检验的组织,必须以无菌技术采集,组织
应分别放入灭菌的容器内并立即密封,贴上标签,放入冷藏容器立即
送实验室。如果时间较长,可作冻结状态运送,也可将组织块浸泡在
,并按每毫升保护液加
入青霉素、链霉素各1000IU,然后放入冷藏容器内送实验室。
2、细菌检验样品。供细菌检验的组织样品,应新鲜并以无菌技术采
集。如遇尸体已经***,某些疫病的致病菌仍可采集于长骨或肋骨,
从骨髓中分离细菌。采集的所有组织分别放入灭菌的容器内并立即密
封,贴上标签,放入冷藏容器立即送实验室。
四、粪便样品的采集:.
1、病毒检验样品。分离病毒的粪便必须新鲜。少量采集时,以灭菌
的棉拭子从直肠深处或泄殖腔粘膜上蘸取粪便,并立即投入灭菌的试
管内密封,。贴上标签冷
藏送实验室。
2、细菌检验样品。作细菌检验的粪便,最好在动物使用抗菌药物之
前,从直肠或泄殖腔粘膜上采集,采样方法与供病毒检验的相同。可
投入无菌缓冲盐水或肉汤的指形管内,贴上标签冷藏送实验室。
3、寄生虫检验样品。粪便样品应选取新排出的或直接从直肠内采得,
以保持虫体或虫体节片及虫卵的固有形态,一般寄生虫检验的粪便用
量较多。采得的粪便以冷藏不冻结状态送实验室。
第三节几种畜禽疫病的样品采集
一、口蹄疫样品的采集、保存和运送
口蹄疫病毒在病畜的水疱皮内及其淋巴液中含毒量最高。在水疱发展
过程中,病毒进入血流,分布到全身各种组织和体液。在发热期血液
内的病毒含量最高,退热后在奶、尿、口涎、泪、粪便等都含有一定
量的病毒。
(一)组织样品
1、样品的选择:.
用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物(牛、羊或猪)未破裂的水泡皮
和水泡液为最好。对临床健康但怀疑带毒的动物可在扑杀后采集淋巴
结、脊髓、肌肉等组织样品作为检测材料。
2、样品的采集和保存
样品采集部位可用清水清洗(切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦
拭),剪取病畜的新鲜水泡皮3~5克放入灭菌小瓶中,加适量50%
甘油/磷酸盐缓冲液(),加盖密封;也可采用无菌器具采集水
泡液至少1毫升,装入灭菌小瓶中(可加适量抗菌素),加盖密封。尽
快冷冻保存。
3、在无法采集水泡皮和水泡液时,可采集淋巴结、脊髓、肌肉等组
织样品3~5克装入洁净小瓶内,加盖密封尽快冷冻保存。
样品的包装瓶上均要贴上标签,写明采样地点,动物种类,编号,时
间等。
(二)牛、羊食道—咽部分泌物(O—P液)样品
1、样品采集
被检动物在采样前禁食(可饮水)12小时,以免胃内容物反流污染
O—P液。%柠檬酸或2%氢氧化钠浸泡5
分钟,再用洁净水冲洗。每采完一头动物,探杯要重复进行消毒并充:.
分清洗。采样时动物站立保定,将探杯随吞咽动作送入食道上部10~
15cm处,轻轻来回移动2~3次,然后将探杯拉出。
2、样品的保存
将采集到的8~10mLO—P液倒入25mL以上的灭菌玻璃容器中,容器
中应事先加有8~10mL细胞培养液或磷酸缓冲液(、
),密封后充分摇匀后尽快冷冻保存,用于病原检测,做出追
溯性诊断。
(三)血清
怀疑曾有疫情发生的畜群,错过组织样品采集时机时,可无菌操作采
集动物血液,每头不少于10mL。无菌分离血清装入灭菌小瓶中,加
盖密封后冷藏保存,通过检测抗体,做出追溯性诊断。
(四)采集样品时要填写样品采集登记表(见附表4)。
(五)装样玻璃容器必须密封,即防水又不透气。样品容器需加贴防水
标签,并写明样品编号、采集地点、动物种类、时间等。
(六)样品运送。运输前将样品玻璃容器装入金属套筒中,套筒应填
充防震材料,加盖密封,与采样记录一同装入专用运输容器中。专用
运输容器应隔热坚固,内装适当冷冻剂和防震材料。外包装上要加贴
生物安全警示标志。:.
二、禽流感的样品采集、保存和运输
病毒主要在呼吸道粘膜细胞内增殖。
(一)病禽
1、至少从5只濒死禽采集样品。样品包括:泄殖腔拭子和气管拭子(置
于缓冲液中)各5个(小珍禽可采集新鲜粪便);气管和肺的混样5个,
肠管及内容物的混样5个;肝、脾、肾和脑等组织样品(不能混样)
各5个。
采集方法:1)泄殖腔棉拭子:将棉拭子插入肛门并旋转,使粪便沾在
拭子上,后放在运输缓冲液中。2)气管棉拭子:活鸡采样时,将棉拭
子插入活鸡的气管内,轻轻擦拭气管壁并放入缓冲液中。死亡动物采
气管样品时,可在肺和气管离体情况下进行采集,应将棉拭子插入较
深部位用力擦拭,并按上述方法将棉拭子放在运输缓冲液中。3)粪便
样品:可从活禽市场采取新鲜粪便,用棉拭子沾取粪便,并将采好的
样品放在运输缓冲液中。
2、分别采集至少10个病鸡的血样(急性发病期血清)。采集10只病
禽的血样,使用一次性采血器,心脏或翅静脉采血,每只禽采血样
2ml~3ml,经离心或自然析出血清后,将血清移到指形管中。封好口,
贴好标签。不同禽只的血样不能混合。
(二)病死禽:.
无发病禽时,可从死亡不久的病禽采样,采样要求同病禽。
棉拭子单独放入容器,~
PBS液。抗生素的选择视当地情况而定,组织和气管拭子悬液中加入
青霉素(20001U/mL)、链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50цg/mL)、
制霉菌素(100001U/mL)。但粪便和泄殖腔拭子所用的抗生素浓度应
提高5倍。。
(三)样品的保存和运输
1、血样要单独存放,不能混合。
2、样品应密封于塑料袋或瓶中,置于有制冷剂的容器中运输,容器
必须密封,防止渗漏。
3、样品若能在24小时内送到实验室,冷藏运输。否则,应冷冻运输。
若样品暂时不用,则应冷冻(最好-70℃或以下)保存。
三、猪瘟
猪瘟病毒复制的主要部位是扁桃体,然后经淋巴管进入淋巴结,继续
增殖,随即到达外周血液,从这时起病毒在脾、骨髓、内脏淋巴结和
小肠的淋巴结组织繁殖到高滴度。
样品:全血、骨髓、淋巴结、扁桃体、肾脏、脾脏:.
四、猪链球菌病
致病性链球菌经呼吸道或其它途径(受损的皮肤和粘膜)进入机体后,
首先在入侵处繁殖,很快进入淋巴管和淋巴结。继之冲破淋巴屏障,
沿淋巴系统扩散到血液中,引起菌血症,最后导致各个实质器官严重
病变。
样品:生前:抗凝全血,死后:肝脏、脾脏
五、新城疫
新城疫病毒存在于病鸡所有器官、体液、分泌物和排泄物,以脑、脾
和肺含毒量最高,骨髓含毒时间最长。
样品:眼分泌物、泄殖腔拭子、脾脏、气管粘膜、脑等。