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由木质素衍生的化合物生物生产芳香族化学品的制作方法
本文所提供的教导总体而言涉及使用酶的生物转换工艺将木质素衍生的化合物转换为有价值的芳香族化学品的方法。本文所述的教导提供了以下选择:(i)对在木质素级份中存在的毒性化合物耐受的宿主细胞;(ii)可以在将木质素级份生物转换为芳香族化学品产物中作为酶使用的多肽;(iii)可以用于转化宿主细胞从而在木质素级份的生物转换中表达作为酶的所选多肽的多核苷酸;以及(iv)表达酶的转化子。
【专利说明】由木质素衍生的化合物生物生产芳香族化学品
[0001]
[0002]
[0003]
[0004]
相关申请的交叉引用
本申请要求9/15/,440和10/25/2010提交的美国临时申请61/455,709的优先权,这些申请在此均以引用方式全文并入本文。
序列表
本申请与序列表的ASCII规格的文本文件一起提交。所附文件的名称为ALIGP004US01_SEQLIST_AS-,并且该文件于
2011年8月29日创建,大小为813KB,并在此以引用方式全文并入本文。由于ASCII规格的文本文件作为§(c)所必需的纸版和§(e)所必需的CRF,所以根据联邦公报(FederalRegister)/,,.§(f),不再需要指明序列表的纸版和CRF拷贝是等同的陈述。
【背景技术】【技术领域】
[0005]本文提供的教导总体而言涉及使用酶,通过生物转变工艺将木质素衍生的化合物转变为有价值的芳香族化学品的方法。
_6]相关领域的描述`
[0007]当前,全世界整体性地依赖石油作为用于制造燃料和化学品的可能耗尽的原料。使用石油的问题是如此公知的,并记录为它们对于世界人口而言几乎已经成为陈词滥调。简言之,基于石油的工艺是脏且危险的。与石油应用相关的环境影响是已知的,例如包括空气污染、全球变暖、提取产生的损伤、油泄露、油球以及对人、家畜和野生生物的健康危害。
[0008]例如,油的精炼是主要生产汽油的基于石油的工艺。然而,它们还广泛地用于生产在药物、农用化学品、食品原料和塑料的制造中有价值的且鲜有人知的化学产物。该市场范围的清洁绿色备选物受到全球范围的重视。
[0009]生物加工可以将清洁绿色的备选物提供给基于石油的工艺,所述的生物加工为使用有机体、细胞、细胞器或酶来进行商业化工艺的加工方法。例如,生物精炼可以生产例如化学品,热和动力,以及食品、饲料、燃料和工业化学产物。生物精炼的实例可以包括湿磨和干磨玉米粉、制浆和造纸厂以及生物燃料工厂。在制革过程中,使用蛋白酶软化毛皮并除去头发。在酿造中,在发芽大麦中使用淀粉酶。在干酪制造中,使用凝乳酶来凝结蛋白质(以密尔计)。例如,近来,生物燃料工厂成为焦点,其自然而然地集中与燃料产物来替代基于石油的燃料,结果不再研发同样依赖于基于石油工艺的其他有价值的化学产物。
[0010]由此,生物精炼使用酶来将天然产物转换为有用的化学品。天然产物(例如在制浆和造纸厂中使用的木材)包含纤维素、半纤维素和木质素、硬木的典型组成范围可以为大约40-44%纤维素、大约15-35%半纤维素、以及大约18-25%木质素。同样,软木的典型组成范围可以为大约40-44%纤维素、大约20-32%半纤维素、以及大约25-35%木质素。由于所有的生物燃料均得自纤维素质的生物精炼,其中重要的原材料为葡萄糖,其衍生自纤维素,所以木质素保持未充分利用。在自然界中,木质素为芳香族化合物的单一的最丰富的来源,并且木质素的用途目前局限于低价值的应用,例如燃烧生成用于生物精炼设备的过程热和能量。备选地,木质素作为动物饲料或肥料的天然成分被出售。然而,有趣的是木质素为基于芳香族核心结构的唯一的植物生物质成分,并且所述的核心结构在工业化学品的生产中是有价值的。技术人员理解的是
:不幸地,此类木质素应用的主要问题仍保留:存在于生物精炼的木质素级份中的芳香族化合物包括抑制工业微生物生长和存活的毒性化合物。至少鉴于这些原因,使用工业微生物将木质素级份转换为工业产物的工艺仍未成功。
[0011]基于上文所述,技术人员理解的是:(i)在生产有价值的化学产物(包括主要的市场,例如药物、农用化学品、食品原料和塑料)中,清洁绿色替代基于石油的工艺;(ii)有益地利用在木质素中得到的大量且可再生的天然来源,其目前为工业废物流,其作为工业原料是未经充分利用的;(iii)选择对原料的木质素级份中存在的毒性化合物耐受的宿主细胞;(iv)选择可以在木质素级份生物转换为有价值的化学产物的过程中用作酶的多肽;
(v)选择可以用于转化宿主细胞从而在木质素级份转换为有价值的化学产物的过程中表达所选择的多肽的宿主细胞;(Vi)包含表达酶的转化子的系统,其中所述的转化子可以用于(a)表达酶,同时与木质素级份直接接触;或者(b)表达由细胞进行提取的酶,其后将提取的酶与木质素级份直接接触;以及(vii)在高于基于石油工艺的收益下生产有价值的化学产物的清洁绿色方法。
[0012]发明概述
[0013]本发明总体而言涉及生产用于将木质素衍生的化合物生物转变为有价值的芳香族化学品的酶的重组方法。在一些实施方案中,所述的教导涉及分离的重组多肽,其包含与SEQIDNO:101具有至少95%的一致性的氨基酸序列。该序列可以保留残基T19,120,S21,P22,V24,W25,T27,K28,Y29,A30,H33,K34,G35,F36,D39,140,V41,P42,G43,G44,F45,G47,148,E50,R51,T52,G53,G54,K100,A101,N104,VIII,G112,M115,F116,P166,W107,Y184,Y187,R188,G191,G192和F195。
[0014]在一些实施方案中,所述的教导涉及分离的重组多肽,其包含SEQIDNO:101;或者该序列的保守残基以外的保守性取代。保守的残基可以包括T19,120,S21,P22,V24,W25,T27,K28,Y29,A30,H33,K34,G35,F36,D39,140,V41,P42,G43,G44,F45,G47,148,E50,R51,T52,G53,G54;K100,A101,N104,Vlll,G112,M115,F116,P166,W107,Υ184,Υ187,R188,G191,G192和F195。
[0015]在一些实施方案中,所述的教导涉及分离的重组谷胱甘肽S转移酶,其包含与SEQIDNO:101具有至少95%的一致性的氨基酸序列。该序列可以保留残基Τ19,120,S21,P22,V24,W25,T27,K28,Y29,A30,H33,K34,G35,F36,D39,140,V41,P42,G43,G44,F45,G47,148,E50,R51,T52,G53,
G54;K100,Α101,N104,Vlll,G112,M115,F116,P166,W107,Y184,Y187,R188,G191,G192和F195;其中所述的氨基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
[0016]在一些实施方案中,所述的教导涉及分离的重组谷胱甘肽S转移酶,其包含与SEQIDNO:101具有至少95%的一致性的氨基酸序列;其中所述的氨基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
[0017]在一些实施方案中,所述的教导涉及分离的重组多肽,其包含:(i)长度范围为大约279至281的氨基酸;(ii)由以下部分构成的第一氨基酸区域:得自SEQIDNO:101的残基19-54,或其除保守残基T19,120,S21,P22,V24,W25,T27,K28,Y29,A30,H33,K34,G35,F36,D39,140,V41,P42,G43,G44,F45,G47,148,E50,R51,T52,G53和G54以外的保守性取代;其中所述的第一氨基酸区域可以定位于大约残基14至大约残基59的重组多肽中;以及(iii)由以下部分构成的第二氨基酸区域:得自SEQIDNO=IOl的残基98-221,或其除保守残基K100,A101,N104,VIII,G112,M115,F116,P166,W107,Y184,Y187,R188,G191,G192和F195以外的保守性取代;其中所述的第二氨基酸区域定位于大约残基93至大约残基226的重组多肽中。
[0018]在一些实施方案中,所述的教导涉及分离的重组谷胱甘肽S转移酶,其包含:(i)长度范围为大约279至281个氨基酸;
(ii)第一氨基酸区域,其具有与得自SEQIDNO:101残基19-54具有至少95%的一致性,同时保留了残基1'19,120,521,?22,￥24,[5,了27,1(28,Y29,A30,H33,K34,G35,F36,D39,140,V41,P42,G43,G44,F45,G47,148,E50,R51,T52,G53和G54;其中所述的第一氨基酸区域定位于大约残基14至大约残基59的重组多肽中;以及(iii)第二氨基酸区域,其具有与得自SEQIDNO:101残基98-221具有至少95%的一致性,同时保留了残基K100,A101,N104,VIII,G112,M115,F116,P166,W107,Y184,Y187,R188,G191,G192和F195;其中所述的第二氨基酸区域可以定位于大约残基93至大约残基226的重组多肽中;并且所述的重组谷胱甘肽S转移酶可以起到切割β-芳基醚的作用。
[0019]在一些实施方案中,所述的教导涉及分离的重组谷胱甘肽S转移酶,其包含与SEQIDNO:541具有至少95%的一致性的氨基酸序列;其中所述的氨基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
[0020]在一些实施方案中,所述的教导涉及分离的重组多肽,其包含:(i)长度范围为大约256至260个氨基酸;(ii)由以下部分`构成的第一氨基酸区域:得自SEQIDNO:541的残基47-57,或其除保守残基A47,148,N49,P50,G52,V54,P55,V56,L57以外的保守性取代;其中所述的第一氨基酸区域定位于大约残基
45至大约残基57的重组多肽中;以及(iii)由以下部分构成的第二氨基酸区域:得自SEQIDNO:541的的残基99-230,或其除保守残基R100,ΥΙΟΙ,K104,D107,Mill,N112,S115,M116,K176,L194,1197,N198,S201,H202和M206以外的保守性取代;其中所述的第二氨基酸区域定位于大约残基94至大约残基235的重组多肽中。
[0021]在一些实施方案中,所述的教导涉及分离的重组谷胱甘肽S转移酶,其包含:(i)长度范围为大约279至281的氨基酸;(ii)第一氨基酸区域,其具有与得自SEQIDNO:541残基47-57具有至少95%的一致性,或其除保守残基A47,148,N49,P50,G52,V54,P55,V56,L57以外的保守性取代;其中所述的第一氨基酸区域可以定位于大约残基45至大约残基57的重组多肽中;(iii)第二氨基酸区域,其由SEQIDNO:541的63-76构成;以及(iv)第三氨基酸区域,其具有与得自SEQIDNO:541残基99-230具有至少95%的一致性,或其除保守残基R100,Y101,K104,D107,Mill,N112,S115,M116,K176,L194,1197,N198,S201,H202和M206以外的保守性取代;其中所述的第二氨基酸区域可以定位于大约残基94至大约残基235的重组多肽中;其中所述的重组谷胱甘肽S转移酶起到切割β-芳基醚的作用。
[0022]在一些实施方案中,除保守残基以外的氨基酸取代可以为保守性取代。并且,在一些实施方案中,所述的氨基酸序列可以起到切割芳基醚的作用。
[0023]此外,所述的教导涉及切割β_芳基醚键的方法,其包括:将本文所教导的多肽与木质素衍生的化合物相接触,其中所述的木质素衍生的化合物具有(i)β_芳基醚键;并且(ii)分子量范围为大约180道尔顿至大约3000道尔顿;其中所述的接触是在其中木质素衍生的化合物是可溶的溶剂环境中进行。
[0024]在一些实施方案中,所述的木质素衍生的化合物具有大约180道尔顿至大约1000道尔顿的分子量。在一些实施方案中,所述的溶剂环境包含水。并且在一些实施方案中,所述的溶剂环境包含极性有机溶剂。
[0025]此外,所述的教导还涉及用于生物加工木质素衍生的化合物的系统,该系统包含本文所教导的多肽;木质素衍生的化合物,其具有β_芳基醚键并且分子量范围为大约180道尔顿至大约3000道尔顿;以及所述的木质素衍生的化合物可溶于其中的溶剂;其中所述的系统通过将所述的多肽与所述的木质素衍生的化合物在溶剂中相接触来切割β-芳基醚键。
[0026]此外,所述的教导还涉及重组多核苷酸,其包含编码本文所述的多肽的核苷酸序列。类似地,所述的教导还涉及包含所述的多核苷酸的载体或质粒、以及由能够表达所述的多肽的载体或质粒转化的宿主细胞。
[0027]此外,所述的教导还涉及切割β_芳基醚键的方法,该方法包括:(i)在适于生产本文所教导的多肽的条件下培养本文所教导的宿主细胞;(ii)由宿主细胞培养物回收所述的多肽;以及(iii)将权利要求1所述的多肽与木质素衍生的化合物相接触,其中所述的木质素衍生的化合物具有β-芳基醚键,并且分子量范围为大约180道尔顿至大约3000道尔顿;其中所述的接触是在其中木质素衍生的化合物是可溶的溶剂环境中进行。
[0028]在一些实施方案中,所述的宿主细胞可以为大肠杆菌或固氮菌属菌株,例如棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)。并且在一些实施方案中,所述的木质素衍生的化合物可以具有大约280道尔顿至大约1000道尔顿的分子量。
[0029]此外,所述的教导还涉及用于生物加工木质素衍生的化合物的系统,该系统包括:
(i)本文所教导的转化的宿主细胞;(ii)木质素衍生的化合物,其具有β_芳基醚键,并且分子量范围为大约180道尔顿至大约3000道尔顿;以及(iii)其中木质素衍生的化合物是可溶的溶剂;其中所述的系统通过将本文所教导的多肽与所述的木质素衍生的化合物在溶剂中相接触来切割芳基醚键。