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专利名称:用于蛋白质生产的酵母菌株的制作方法
用于蛋白质生产的酵母菌株
背景技术:
(1)发明领域本发明涉及分子生物学领域,特别是,本发明涉及用于提高从已转化表达系统的蛋白质生产的新颖选择基因。(2)
背景技术:
近年来,芽殖酵母巴斯德毕赤酵母已成为用于学术和商业目的异源蛋白质表达的普遍使用的生物体(Cereghinoetal.,-332(2002);CereghinoandCregg,-66(2000))近期显示可基因修饰巴斯德毕赤酵母的糖基化机制并表达被复合型人类聚糖修饰的异源糖蛋白(Choietal.,-5027(2003);HamiItonetal.,Science3011244-1246(2003);Bobrowiczetal.,Glycobiology14:757—766(2004);Hamilton,Science,3131441-1443(2006))。然而,仍然需要在已转化细胞系例如已转化的巴斯德酵母细胞系中达到更高的细胞生产力的方法和材料。多年来,已研发了许多营养缺陷和显性可选择标记(Higginsetal.,:41_53(1998);LinCereghinoetal.,Gene263159-169(2001)
;NettandGerngross,Yeast201279-1290(2003);Nettetal.,Yeast22:295_304(2005)并用于构建用于各种应用的蛋白质表达载体。通常用在标记基因,在该质粒上的另一同源区或在AOXl启动子片段中被线性化的质粒将感兴趣的基因整合入巴斯德毕赤酵母基因组中并转化至合适的营养缺陷型突变体中。游离DNA末端的同源重组接着得到整合入这些基因座的单交换整合。绝大多数的巴斯德毕赤酵母转化子将包含单拷贝的表达载体,但是对于获得表达高水平感兴趣的蛋白质的转化子通常需要筛选多拷贝整合子。使用包含药物抗性基因如例如的选择标记,可通过增加用于筛选的药物水平增加包含多拷贝表达载体的转化子的数量。单交换型整合的一个显著缺陷在于多个整合的拷贝可通过同源重组瓦解回单个拷贝。在发酵中表达反应的放大中这可能尤其成问题如果感兴趣的蛋白质对细胞具有毒性或表达质粒若干拷贝的逐出(eviction)对细胞具有其他生长益处。美国专利第5,584,039号涉及分离自甲醇毕赤酵母的可选择标记基因ADE2。Piontekφ,-338(1998)^RSchwanniomycesoccidentalis和Pichiastipitis中的新颖基因表达系统,该系统利用包含ADE2标记的载体和推定的复制序列。然而,之前并未从巴斯德酵母中分离出对应的基因,且之前并未鉴定用ADE2在巴斯德酵母中的转化效果。因此,存在用巴斯德毕赤酵母作为宿主表达系统改进异源基因的转化、筛选和表
达的方法的需要。发明概述本发明提供将低级真核细胞例如酵母和丝状真菌作为表达重组蛋白的表达系统的方法和材料。在一个方面,本发明基于构建低级真核生物细胞较缓慢生长的ade2营养缺陷性菌株并使用可整合入该ade2营养缺陷性菌株的基因组并包含编码与启动子可操作连接的ADE2标记基因或开放阅读框(ORF)和重组蛋白的核酸的整合载体,其中整合载体整合入ade2营养缺陷性菌株的基因组,ADE2使得该营养缺陷性菌株为腺嘌呤原养型,且表达该重组蛋白。因此,本发明提供一种表达系统,其包括(a)巴斯德毕赤酵母宿主细胞,其中编码Ade2p的内源ADE2基因已从宿主细胞的基因组中移除;和(b)整合载体,其包括(1)编码Ade2p的核酸;(2)具有用于插入一个或更多个表达盒的插入位点的核酸,该表达盒包括编码一个或更多个感兴趣的异源肽、蛋白质和/或功能核酸的核酸,以及(3)引导所述整合载体通过同源重组插入所述宿主细胞特定位点的靶向核酸。而且,本发明提供用于产生表达异源蛋白或肽的重组巴斯德毕赤酵母宿主细胞的方法,其包括(a)提供宿主细胞,其中编码Ade2p的内源ADE2基因已从宿主细胞的基因组中移除;和(a)用整合载体转化该宿主细胞,所述整合载体包括(1)编码Ade2p的核酸;(2)具有一个或更多个表达盒的核酸,所述表达盒包含编码一个或更多个感兴趣的异源
肽、蛋白质和/或功能核酸的核酸,以及(3)引导所述整合载体通过同源重组插入所述宿主细胞基因组特定位点的靶向核酸,其中该转化的宿主细胞产生该重组蛋白。本发明进一步提供包含巴斯德毕赤酵母的ADE2基因的分离核酸。在具体方面,核酸包含编码Ade2p蛋白的开放阅读框或核酸具有与SEQIDNO60中从核苷酸127至核苷酸1815显示的核酸序列具有95%的同一性的核苷酸序列。本发明进一步提供包含与SEQIDNO61所示氨基酸序列具有95%同一性的氨基酸序列的分离多肽。本申请人进一步发现将营养缺陷标记基因或ORF与整合载体中的最小启动子(即具有低转录活性的启动子)可操作地连接使得可产生包含足够数量拷贝的整合入营养缺陷型宿主细胞基因组中的整合载体的重组宿主细胞,使得该细胞为原养型并使得该细胞可产生大于仅包含单个拷贝的整合入基因组的整合载体的细胞所产生的量的感兴趣的重组蛋白或功能核酸。因此,本发明提供一种方法,其中获得或构建低级真核生物细胞的营养缺陷型菌株并提供可整合入营养缺陷性菌株的基因组的整合载体,且其包含编码补充营养缺陷并与弱启动子、减弱的内源或异源启动子、隐藏的启动子或截短的内源或异源启动子可操作地连接的标记基因或ORF和重组蛋白的核酸。其中许多整合载体被整合入基因组以补充宿主细胞的营养缺陷的宿主细胞筛选自缺乏补充营养缺陷的代谢物的培养基并通过在缺乏补
充营养缺陷的代谢物的培养基中或在包含该代谢物的培养基中(因为在该情况下,逐出了含标记质粒的细胞生长得更慢)增殖该宿主细胞以保存。在进一步的实施方案中,本发明提供一种表达系统,其包括(a)宿主细胞,其中编码营养缺陷型可选择标记蛋白的内源基因从宿主细胞的基因组中移除;和(b)整合载体,其包括(1)包括编码与编码所述营养缺陷可选择标记蛋白的内源基因的功能互补的功能,并与弱启动子、减弱的内源或异源启动子、隐藏的启动子、截短的内源或异源启动子或无启动子可操作地连接的开放阅读框(ORF)的核酸;(2)具有用于插入一个或更多个表达盒的插入位点的核酸,所述表达盒包含编码一个或更多个感兴趣的异源肽、蛋白和/或功能核酸的核酸,以及(3)引导所述整合载体通过同源重组插入所述宿主细胞基因组的特定位点的靶向核酸。
在又进一步的实施方案中,提供了在宿主细胞中表达重组蛋白的方法,其包括(a)提供宿主细胞,其中从宿主细胞的基因组中移除编码营养缺陷可选择标记蛋白的内源基因;和(a)用整合载体转化宿主细胞,该整合载体包括(1)包括编码与编码所述营养缺陷可选择标记蛋白的内源基因的功能互补的功能,并与弱启动子、减弱的内源或异源启动子、隐藏的启动子、截短的内源或异源启动子或无启动子可操作地连接的开放阅读框(ORF)的核酸;(2)具有一个或更多个表达盒的核酸,所述表达盒包含编码一个或更多个感兴趣的异
源肽、蛋白和/或功能核酸的核酸,以及(3)引导所述整合载体通过同源重组插入所述宿主细胞基因组的特定位点的靶向核酸,其中该转化的宿主细胞产生该重组蛋白。在上述实施方案的进一步方面,所述营养缺陷可选择标记蛋白由选自ADE,URA和LYS的基因编码。在又进一步方面,所述营养缺陷可选择标记蛋白由ADEl基因或ADE2基因编码。在又进一步方面,所述整合载体包括用于插入一个或更多个编码一个或更多个感兴趣的异源肽、蛋白质和/或功能核酸的多个插入位点。在又进一步方面,所述整合载体包括多于一个的表达盒。在又进一步方面,所述整合载体在表达盒之间包括很少或无同源DNA序列。在又进一步方面,所述整合载体包括编码单克隆抗体轻链的第一表达盒和编码单克隆抗体重链的第二表达盒。在又进一步方面,所述宿主细胞为低级真核生物。在又进一步方面,所述宿主细胞来自选自以下的物种巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris),Pichiafinlandica,Pichiatrehalophila,Pichiakoclamae,IMH^1F^(Pichiamembranaefaciens),Pichiaminuta(Ogataeaminuta,Pichialindneri),Pichiaopuntiae,Pichiathermotolerans,Pichiasalictaria,Pichiaguercuum,Pichiapijperi,Pichiastiptis,￥If^1F母(Pichiamethanolica),毕赤酵母属物种(Pichiasp.),酿酒酵母
(Saccharomycescerevisiae),酵母属物禾中(Saccharomycessp.),多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha),克鲁维酵母属物种(Kluyveromycessp.),乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis),白假丝酵母(Candidaalbicans),构巢曲霉(Aspergillusnidulans),黑曲霉(Aspergillusniger),米曲霉(Aspergillusoryzae),里氏木霉(Trichodermareesei),Chrysosporiumlucknowense,键抱菌属物禾中(Fusariumsp.),Fusariumgramineum,Fusariumvenenatum,小立碗藓(Physcomitrellapatens),和粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)。在又进一步方面,权利要求1的表达系统,其中所述宿主细胞为经修饰可产生具有杂合型或复合型N-聚糖的糖蛋白的巴斯德毕赤酵母或巴斯德毕赤酵母细胞。定义除非另外指明,与本发明相关使用的科学和技术术语及短语应具有本领域技术人员通常理解的含义。另外,除非上下文所需,单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。一般地,与本文所述生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学和以及蛋白质和核酸化学和杂交相关使用的命名和技术为本领域熟知和常用的那些。除非另外指明,本发明方法和技术通常根据本领域已知的常规方法和如本说明书中通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献所述实施。参见,例如,,2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,.(1989)
;Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992,andSupplementsto2002);HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,.(1990);TaylorandDrickamer,IntroductiontoGlycobiology,(2003);WorthingtonEnzymeManual,WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,NJ;HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolI,CRCPress(1976);HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolII,CRCPress(1976);EssentialsofGlycobiology,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)。Ι^的^的出版物、专利和其他参考文献以其完整内容通过引用并于本文。本文中使用命名酵母染色体基因的遗传命名法。各基因、等位基因或基因座由三个斜体字母表示。显性等位基因通过用基因标志的所有字母的大写字母表示,例如ADE2用于表示腺嘌呤2基因,而小写字母表示隐性等位基因,例如,腺嘌呤2的营养缺陷标记,ade2。野生型基因用上标〃+〃表示而突变体用〃上标表示。标志Δ可表示部分或完全缺失。基因的插入遵循细菌命名法,使用标志〃〃,例如,
trp2ARG2表示在TRP2基因座插入ARG2基因,其中ARG2为显性(且有功能的)且trp2为隐性(和缺陷的)。由基因编码的蛋白质由相关的基因标志(非斜体的)提及,该标志具有起始的大写字母且通常具有后缀"P",例如由ADE2编码的腺嘌呤2蛋白为Ade2p。表型由对应于基因标志的非斜体三字母缩写表示,起始字母为大写。野生型菌株由"+"上标表示而突变体由"上标表示。例如,Ade2+为野生型表型而Ade2_为营养缺陷型表型(需要腺嘌呤)。本文所用术语“载体”意指可转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种载体类型为“质粒”,其指可向其中连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一载体类型病毒载体,其中另外的DNA区段可连接入病毒基因组中(下文中详细讨论)。某些载体可在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如,具有在宿主细胞中发挥功能的复制起点的载体)。其他载体可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组中并藉此随着宿主基因组复制。而且,某些优选的载体可引导它们可操作连接的基因的表达。该类载体在本文中称作“重组表达载体”(或简单称作“表达载体”)。术语“整合载体”指可整合入宿主细胞并携带选择标记基因或开放阅读框(ORF)、靶向核酸、一种或更多种感兴趣的基因或核酸以及功能为微生物自主DNA复制起始位点(下文中称作DNA
复制起点,例如细菌的ORI)的核酸序列的载体。整合载体仅可在宿主细胞中复制,如果其通过DNA重组方法例如将线性DN***段整合入宿主细胞基因组特定基因座的同源重组整合入宿主细胞基因组。举例而言,靶向核酸将整合载体靶向基因组中的对应区域,在那里其可接着通过同源重组整合入基因组。术语“可选择标记基因”、“选择标记基因”、“可选择标记序列”等指携带于载体上并就不含标记基因的宿主而言赋予已转化宿主遗传优势的基因或核酸序列。举例而言,巴斯德毕赤酵母URA5基因为可选择标记基因因为它的存在可通过包含该基因的细胞在没有尿嘧啶下生长的能力而被选择。它的存在也可通过包含该基因的细胞不能在5-F0A存在下生长被选择。可选择标记基因或序列不一定需要显示阳性和阴性可选择性二者。来自巴斯德毕赤酵母的标记序列或基因的非限制性实例包括ADE1,ADE2ARG4,HIS4,LYS2,URA5和URA3。一般而言,如如本文公开的表达系统使用的可选择标记基因编码补充宿主营养缺陷突变的基因产物。营养缺陷突变或营养缺陷型为生物体不能合成特定的其生长需要的有机化合物或代谢物(如IUPAC定义)。营养缺陷体为显示这一特性的生物体;营养缺陷的是对应的形容词。营养缺陷型与原养型相对。术语“靶向核酸”指携带于载体质粒上引导载体整合质粒通过同源重组插入宿主中被称作“靶基因座”的特定同源基因座的核酸。术语“感兴趣的序列