hUNC93B1基因的克隆、表达纯化及抗体制备.doc

hUNC93B1基因的克隆、表达纯化及抗体制备
【Abstract】AIM: To construct the prokaryotic expression vector containing hUNC93B1 gene, then induce the expression of this gene and purify the fusion protein, and at last using target protein to make the specific and high titer antibody. METHODS: The specific primers of hUNC93 gene plified by PCR. The PCR product n by virtue of its (His)6 tag. Rabbits muned munological adjuvant for specific antibody preparation. RESULTS: An 1808bp length fragment plified by PCR. The sequence atched in 1∶64 000 akes it possible to do further investigation on the relationship betUnc93b,鸡的cUnc93b,线虫的unc93和果蝇的AF145657等具有很高的同源性. 线虫的unc93基因对肌肉的收缩和及其共济运动具有重要的作用,当unc93基因发生等位基因的突变时,线虫将发生运动迟缓,并伴发运动的共济失调现象[2]. 为研究hUNC93B1基因与人心血管疾病之间的具体机制,我们设计了针对人hUNC93B1的特异性引物,通过PCR的方法扩增得到该基因片段,测序全部正确后亚克隆入原核表达载体,构建了hUNC93B1pRSETA载体. 转化入大肠杆菌BL21中,诱导表达并纯化出该蛋白. 用表达的蛋白免疫家兔,以获得了特异性和效价都相对较高的多克隆抗血清.
1材料和方法
A ,感受态细胞 BL21和XL10由本校生化教研室提供,PCR引物由北京赛百盛公司合成;人脑cDNA组文库购自Clontech公司,质粒提取和PCR产物胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司;Taq DNA 聚合酶,PCR marker,T4 DNA 连接酶,pMD18T 载体,SacI, HindIII及IPTG均购自大连宝信生物公司. 金属螯合亲和层析中所用Ni2+NTA琼脂糖介质购自Qiagen公司;HRP标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz Biotechnology;_030930),利用Primer Premier ,在其编码区的两端设计一对引物,序列:Up为5′GC GAGCTC ATG GAG GCG G CTC3′;Loin,加入1 U Taq DNA聚合酶,在PE2400 PCR 循环仪中反应, 用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物.
扩增产物用安徽优晶生物工程公司胶回收试剂盒回收,将回收的目的片段克隆到测序载体pMD18T中,送上海基康公司进行D