RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGFβ1刺激后胶原合成的影响.doc

RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGFβ1刺激后胶原合成的影响.docRNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGFβ1刺激后胶原合成的影响
【关键词】 RNA干扰;人瘢痕成纤维细胞;胶原蛋白;转化生长因子β1
Abstract: Objective To investigate the effect of small interfering RNA(siRNA) expressing plasmids targeting connective tissue groan keloid fibroblasts(HKFs). Methods Constructed siRNAexpressing plasmids targeting CTGF easured by 3Hproline incorporation method before and after HKFs ulated by transforming groL. Results The collagen level al level and had no obvious change even after stimulated by TGFβ1. Conclusion The doids may be a nean keloid fibroblast; collagen; TGFβ1
瘢痕疙瘩(Keloid,KD)是皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后引发的以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的过度瘢痕化,其发病机制是异常表达的转化生长因子(TGFβ1)通过结缔组织生长因子(CTGF)促进病理性瘢痕的形成[1]。已有研究表明,TGFβ是一类具有多种生物学功能的蛋白多肽类物质,在创伤愈合的所有阶段均发挥了重要作用[2]。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(doublestrands RNA,dsRNA)介导的基因沉默技术,通过长度21~23个核苷酸的双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)与细胞内相对应的mRNA结合,特异性降解mRNA,抑制蛋白表达,具有特异性、高效性和方便性等显著特点[23]。本研究旨在将体外构建的结缔组织生长因子siRNA表达载体转染导入人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKFs)后,观察TGFβ1刺激前后细胞外胶原蛋白分泌水平的变化,为瘢痕疙瘩的基因治疗提供依据。
1材料与方法

质粒pGenesil1(武汉晶赛生物公司),Dosper脂质体(Roche,德国),DMEM高糖培养基(Gibco,美国),液体闪烁仪(SN6930,上海)。

(诊断标准参见文献[4])术中切除的组织,用组织法分离HKFs,加入10%小牛血清的DMEM培养基,培养条件为37 ℃、5%CO2,胰酶消化传代,取体外培养第5代细胞。
、鉴定和转染方法详见文献[5],本实验采用抑制效率最高的靶序列进行转染。转染细胞分为重组质粒组和空质粒组,每组各5份细胞样本。
脯氨酸(3Hpro)渗入法检测胶原蛋白将3Hpro原液配成20×稀释的使用液,在每组细胞中加入20 μL,37 ℃、5%CO2培养6 h。弃去培养液, mL冰预冷的10%TCA,4